甘蓝型油菜EMS突变体库的构建及TILLING、EcoTILLING技术的应用研究

摘要

突变体是某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突变的生物体材料。早期的遗传学家和育种家们主要在小范围内筛选感兴趣的突变体，随着近年来多种生物基因组序列的测序完成，大量基因等待着人们去诠释其功能，因此小范围的获得突变体已经不能满足科研和育种的需要。所以，在后基因组时代，创建能够使突变覆盖某一生物体全基因组的突变体库成为必然。在芸苔属植物中，目前很少有大型突变体库构建的报道。此外，如何构建突变体库以及如何检测和筛选这些突变体成为困扰研究人员新的难题。TILLING（靶向诱导基因组局部突变）技术是近年来发展起来的一门反向遗传学技术，目前已经成功应用于动植物功能基因组研究和作物遗传育种中。该技术主要用于针对靶基因筛选由人工诱变产生突变体库中的突变体。芥酸是芸苔属作物种子中脂肪酸重要成分，也是衡量芸苔属作物品质的重要性状之一。作为食用而进行利用的甘蓝型油菜种子中低芥酸含量是其育种的重要目标，但对于甘蓝型油菜而言，低芥酸种质资源是相当匮乏的。调查已有自然和人工培育品种种子中芥酸含量的变异，以及创建新的低芥酸种质资源对于芸苔属，尤其是甘蓝型油菜意义十分重大。
　　 本研究首先利用甘蓝型油菜半冬性品种宁油7号（Ningyou7）的一个DH系作为野生型亲本材料，通过EMS诱变剂诱变后获得了大型突变体库。该突变体库利用了两种EMS诱变浓度。0.6％EMS浓度的突变体库包含M2代单株7110；0.3％EMS突变体库包含M2代单株3926。同时，还获得了这些突变体材料M2代自交种子和其对应的DNA。然后，对突变体库所有材料M2代生育期内的性状进行了调查。主要包括株型、叶片性状、开花期相关形状、育性、M3代部分种子含油量等。经过调查发现，本研究构建的突变体库中含有大量表型变异突变体。
　　 在TILLING技术平台构建实验中，首先利用甘蓝型油菜Tapidor基因组BAC文库，筛选并获得了FAE1基因对应的克隆。对筛选获得FAE1的BAC克隆进行分析，发现该基因在甘蓝型油菜基因组中存在两个拷贝。然后利用本实验室构建的作图群体（TN mapping population），结合分析FAE1 BAC克隆的序列信息，开发分子标记，将两个拷贝的FAE1定位在了甘蓝型油菜遗传连锁图．A8和C3连锁群上；同时利用两年两点的作图群体种子芥酸数据定位了甘蓝型油菜种子中芥酸含量的QTL，发现两个拷贝的FAE1基因位于两个芥酸主效QTL的峰值处。然后，通过改进的TILLING技术，在构建的甘蓝型油菜EMS突变体库中筛选了FAE1基因的突变体。在1344个M2单株中共获得了19个单株在FAE1筛选区段含有突变位点。计算获得了两种不同浓度诱变产生突变体库的突变密度。对于0.3％EMS诱变浓度的单株，对应的突变密度为每单株每130.8 kb含有一个突变位点；0.6％EMS诱变浓度群体，对应的突变密度为每单株每41.5 kb含有一个突变位点。选取其中两个种子中芥酸变异单株进行详细遗传分析，发现这些突变体芥酸的降低均因为．FAE1基因的变异。
　　 在EcoTILLING技术平台构建及芥酸变异关联分析实验中，首先收集了128份芸苔属品种，其中白菜8份、甘蓝9份、甘蓝型油菜101份。利用气相色谱分析法分析了这些不同品种种子中芥酸的含量，发现在这近130份收集品种，既有高芥酸品种，也有中芥酸和低芥酸品种。然后，利用EcoTILLING技术分析了甘蓝型油菜101份品种两个拷贝FAE1的多态性，并且分析了这些多态性和高低芥酸的关联性。同时还分析了白菜、甘蓝品种中高低芥酸产生的可能原因。最后，利用EeoTILLING实验中推断出的甘蓝型油菜单倍型序列和白菜、甘蓝测序分析获得的单倍型序列对芸苔属A、C基因组间的进化关系进行了深入分析。获得了能够区分A、C基因组的标记。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表(Abbreviation)

声明

1 前言

1.1 植物突变体库研究进展

1.1.1 突变体与植物突变体库

1.1.2 植物突变体库构建方法概述

1.1.3 油菜基因组特点与突变体库的构建

1.2 TILLING，EcoTILLING技术基本原理与应用

1.2.1 反向遗传学TILLING技术原理

1.2.2TILLING技术的应用

1.2.3 EcoTILLING技术原理及其应用

1.2.4 TILLING，EcoTILLING技术的评估和应用前景

1.3 芸苔属芥酸及其合成途径中关键基因FAEl研究进展

1.3.1 芥酸合成的生化途径

1.3.2 控制芥酸合成的关键基因FAE1的克隆及其表达模式

1.3.3 芸苔属高低芥酸品种的选育

1.4 本研究问题的提出及其研究目的和意义

2 甘蓝型油菜EMS突变体库的构建及对其正向遗传学的评估

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料及试剂

2.1.2 不同浓度EMS诱变剂诱变种子

2.1.3 种子的诱变

2.1.4 突变体库的繁育和DNA的抽提及编号

2.1.5 突变体库M2代田间表型的调查

2.1.6 部分M3代种子含油量的测定及数据分析

2.2 结果与分析

2.2.1 不同浓度EMS诱变宁油7号种子的差异

2.2.2 突变体库的构建

2.2.3 突变群体中种子含油量的变异

2.2.4 两种不同浓度EMS诱变群体M2代表型调的查比较

2.3 讨论

2.3.1 甘蓝型油菜突变体库构建和其应用价值

2.3.2 EMS诱变浓度与突变体库的构建

2.3.3 表型评估突变体库的不足

3 甘蓝型油菜TILLING技术平台构建及反向遗传学技术评估突变体库

3.1 材料与方法

3.1.1 FAE1基因引物的设计

3.1.2 BAC文库的筛选及BAC克隆的分析

3.1.3 FAE1基因定位及芥酸QTL检测

3.1.4 CEL.1酶的抽提

3.1.5 甘蓝型油菜TILLING技术体系的建立及FAE／突变体筛选

3.1.6 FAE1突变单株基因型分析和芥酸含量测定

3.1.7 利用数据库中FAE1序列分析自然SNP位点

3.1.8相关数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 甘蓝型油菜FAE1拷贝数分析

3.2.2 FAE1定位及其甘蓝型油菜芥酸QTL分析

3.2.3 甘蓝型油菜TILLING技术体系的建立

3.2.4 FAE1突变体的筛选及其验证

3.2.5 FAE1突变体表型鉴定及其遗传分析

3.2.6 EMS突变体库的反向遗传学的评估

3.2.7 FAE1人工诱变产生的变异和自然变异比较分析

3.3 讨论

3.3.1 多倍体植物中TILLING技术的应用

3.3.2 甘蓝型油菜TILLING技术体系建立

3.3.3 EMS诱变浓度与突变体库突变密度

3.3.4 甘蓝型油菜低芥酸种质资源的筛选

3.3.5 利用公共数据库中数据人工筛选SNP可行性和缺点

3.3.6 一种全新基因功能验证思路：从关键性状的QTL定位到TILLING技术筛选突变体进行功能验证

4 应用EcoTILLING技术分析芸苔属3个种的FAE1基因多态性及其与种子中芥酸含量的关联性

4.1 材料与方法

4.1.1 品种的种植和DNA样品获得及各品种种子中芥酸含量测定

4.1.2 引物设计

4.1.3 EcoTILLING分析甘蓝型油菜FAE1多态性及其验证

4.1.4 单倍型和进化树的构建

4.1.5 数据分析

4.2 结果与分析

4.2.1 不同品种种子中芥酸含量分析

4.2.2 芸苔属3个种种内和种间FAEl基因多态性分析

4.2.3 高低芥酸与其基因型关联分析

4.2.4 芸苔属A、C基因组间进化分析

4.3 讨论

4.3.1 EcoTILLING在植物基因组研究中的应用

4.3.2 芸苔属白菜、甘蓝和甘蓝型油菜自然群体中低芥酸种质资源

4.3.3 芸苔属A、C基因组进化

5 研究结论与展望

5.1 研究结论

5.2 研究展望

参考文献

附录

致谢

作者简介及在读期间已发表或待发表SCI论文