红树林根际土壤固氮细菌和功能基因nifH的多样性研究

摘要

本研究利用阿须贝无氮培养基，从9种红树林植物根际土壤分离得到12种好氧自生固氮细菌，通过PCR扩增，获得全部菌株的16S rDNA序列以及9种菌株的，n ifH序列，根据这两种序列分别建立了系统发育树，比较显示，仅部分菌株在两种系统发育树中表现出相似的聚类结果，证明16S rRNA和nifH归是两种进化速率不同的基因；并发现供试根际土壤可培养固氮细菌的优势类群分布于变形菌纲。进一步利用“PCR-克隆-测序”免培养法，从3种红树植物根际土壤克隆获得27种nifH序列，与有关文献公布的nifH序列一起建立了系统发育树。分析表明：在同一地域红树林生态系统的不同根际土壤样品中，固氮细菌的分布存在差异，在理化性质差异明显的土壤样品之间，这种差异更为显著；首次报道来自同一地域红树林生态系统中的nifH序列倾向于聚集在一起形成相对独立的簇。分析认为，红树林土壤固氮细菌的群落组成在大尺度间具有较强的独立性，其多样性和优势类群更依赖于具体的小尺度环境特性。

目录

文摘

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声明

1前言

1.1红树林生态系统简介

1.1.1红树林生态系统构成和功能

1.1.2红树林土壤性质和特点

1.2红树林生境微生物研究进展

1.2.1红树林生境中的真菌

1.2.2红树林生境中的放线菌

1.2.3红树林生境中的细菌

1.3土壤和环境微生物群落结构研究方法

1.3.1研究策略和技术方法概述

1.3.2荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)

1.3.3变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)

1.3.4末端限制性酶切片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Legth Polymorphism,T-RFLP)

1.3.5单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)

1.3.6基于16S rRNA基因的分析方法

1.4红树林生境固氮微生物群落研究

1.4.1红树林固氮微生物及生态功能

1.4.2固氮微生物多样性研究方法

1.4.3红树林固氮微生物群落研究存在的问题

1.5研究目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1样品

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.1.4 PCR引物

2.1.5分析软件

2.1.6培养基

2.1.7菌株与载体

2.2方法

2.2.1样品采集和保存

2.2.2土壤理化性质测定

2.2.3好氧自生固氮细菌分离与鉴定

2.2.4土壤总DNA提取、纯化

2.2.5 PCR反应

2.2.6 PCR产物纯化

2.2.7连接反应

2.2.8感受态细胞制备

2.2.9转化

2.2.10 nifH克隆文库构建

2.2.11 DNA序列测定

2.2.12 16S rDNA系统发育分析

2.2.13 nifH系统发育分析

2.2.14核苷酸序列GenBank登录号

3.结果与分析

3.1红树林土壤样品理化性质测定

3.2好氧自生固氮细菌分离及鉴定

3.3土壤总DNA提取及质量控制

3.4固氮微生物nifH PCR扩增

3.5克隆文库的构建及测序

3.6分离固氮菌16S rDNA和nifH分子标记的系统发育树比较

3.7红树林培养与免培养法获得nifH序列系统发育分析

3.8红树林固氮微生物nifH序列系统发育分析

4小结和讨论

4.1小结

4.2讨论

4.2.1培养法分离的固氮细菌16S rDNA和nifH序列系统发育

4.2.2红树林根际土壤固氮微生物nifH序列系统发育

4.2.3红树林固氮微生物nifH序列系统发育分析

参考文献

论文投稿情况

致谢

附录