病原菌侵染与拟南芥纤维素合酶基因表达分析

摘要

纤维素是理想的可再生能源,以植物秸秆为代表的生物质能源由于具有储量巨大、可以再生等特点,是生物能源的重要组成部分。如何降低利用生物能源的成本已成为一个重要的科学问题,只有充分了解纤维素合成机理才能从根本上解决。
　　目前已经有许多与纤维素合成相关的基因被报导,就本实验的研究材料拟南芥而言,有10个与纤维素合成有关的纤维素合酶基因(AtCesA1-10),目前普遍认为AtCesA1、AtCesA3和AtCesA6与初生壁的合成相关,AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8与次生壁合成有关,AtCesA9和AtCesA10在生长点表达,但是AtCesA2, AtCesA5, AtCesA9和AtCesA10的具体功能尚不清楚。
　　本文以拟南芥野生型、prc1-1以及AtCesA1-10的启动子融合报告基因GUS的转基因材料为研究对象,分析纤维素合酶基因在拟南芥正常生长和病原菌侵染条件下的表达特性,进一步验证和阐述它们在植物细胞壁合成中的功能。
　　主要结果如下:
　　1.GUS染色结果表明:AtCesA1、AtCesA2、AtCesA3和AtCesA6在拟南芥全生育期的表达时期及表达部位十分相似,主要在拟南芥的根、茎、叶、花和荚果中表达;AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8在拟南芥全生育期的根、茎、叶脉和花中表达;在营养生长时期,AtCesA5的表达与AtCesA1, AtCesA3, AtCesA6相似。在花期,AtCesA5在拟南芥除花器官之外的所有器官中均没有表达。在荚果期时期,AtCesA5在拟南芥的所有器官均未观察到表达;AtCesA9只在拟南芥的莲座叶与茎相连部和花中表达;AtCesA10在拟南芥的全生育期均未观察到表达。
　　2.软腐菌为细菌病原菌,侵染拟南芥叶片6-8 h时,植株发病达到高峰期(此时叶片腐烂25％)。Real time PCR检测表明,大部分基因的表达达到最大值。GUS染色结果表明:在病原菌侵染高峰期,AtCesA1、AtCesA3和AtCesA6基因在病斑周围表达加强,AtCesA2的表达与初生壁纤维素合酶基因的表达十分相似;AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8在病原菌侵染后基因表达没有发生变化,AtCesA5在WT和prc1-1中的表达均有下降,WT中的AtCesA1的基因表达有所下降,其它基因都有不同程度的上升。prc1-1受侵染时AtCesA6表达没有加强,相似功能的其它初生壁基因明显升高,同时AtCesA2基因的表达也有明显升高。
　　3.核盘菌为真菌病原菌,侵染拟南芥12-14 h时,植株发病达到高峰期(此时植株腐烂25％)。GUS染色结果表明:AtCesA1、AtCesA3和AtCesA6基因在病斑周围表达加强,AtCesA2的表达与初生壁纤维素合酶基因表达十分相似;AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8在病原菌侵染后基因表达没有发生变化。Real time PCR结果显示,核盘菌和软腐菌侵染后的AtCesA5在WT中的表达均有所下降,核盘菌侵染后其它基因的表达都有不同程度的上升。prc1-1与WT相比,AtCesA1、AtCesA3、AtCesA6和AtCesA2的表达都有明显升高,AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8和AtCesA5也有一定上升。
　　4.软腐菌与核盘菌侵染的结果基本一致,但核盘菌侵染后Real time PCR表达趋势明显升高。
　　5.病原菌侵染后的prc1-1与WT纤维素成分均未发生明显的变化。

目录

摘要

Abstract

缩写名词表

1 文献综述

1.1 拟南芥纤维素合酶基因

1.1.1 植物细胞壁研究

1.1.2 植物细胞壁与病原菌

1.1.3 植物纤维素

1.1.4 纤维素合酶家族基因

1.1.5 纤维素合酶的复合体结构与功能

1.1.6 纤维素的生物合成

1.2 核盘菌及其致病机理

1.2.1 核盘菌生物学特性

1.2.2 核盘菌致病机制

1.3 软腐菌及其致病机理

1.3.1 软腐菌的生物学特性

1.3.2 软腐菌的致病机理

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料和试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 引物

2.2 方法

2.2.1 拟南芥种植

2.2.2 病原菌培养与接种

2.2.3 植株取材

2.2.4 GUS染色方法

2.2.5 RNA提取

2.2.6 反转录

2.2.7 PCR

2.2.8 病原菌侵染成分分析

2.2.9 六碳糖测定

3 结果与分析

3.1 拟南芥Pro_(CesA1-10)::GUS基因时空表达

3.1.1 营养生长期GUS表达特性

3.1.2生殖生长期GUS表达

3.2 病原菌侵染的拟南芥叶片纤维素合酶家族基因表达分析

3.2.1 软腐菌侵染后部分纤维素合酶基因表达

3.2.2 核盘菌侵染后部分纤维素合酶基因表达

3.3 病菌侵染后CesA1-8的mRNA表达分析

3.3.1 软腐菌侵染后CesA1-8的mRNA表达分析

3.3.2 核盘菌侵染后CesA1-8的mRNA表达分析

3.4 病原菌侵染导致的拟南芥叶片纤维素含量变化

4 讨论

4.1 植物纤维素合酶表达研究方法

4.2 拟南芥纤维素合酶基因在正常生长发育中的作用分析

4.3 拟南芥纤维素合酶基因对病菌侵染的反应

4.4 病菌侵染对拟南芥纤维素的影响

4.5 拟南芥纤维素合酶基因在细胞壁合成中的作用

参考文献

致谢