山羊类胚胎干细胞的分离培养及其来源的上皮样细胞的培养

摘要

胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ES细胞)是从附植前早期胚胎内细胞团(Inner cell mass, ICM)或附植后胚胎原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)分离、克隆出来的,经体外分化抑制培养的一种高度未分化的细胞。ES细胞具有全能性和多能性,是克隆动物、转基因动物、制备乳腺生物反应器等理想的候选细胞。除了某些品系的小鼠和人有较高的ES细胞建系成功率外,其他动物的建系率很低,而山羊至今还没有成功建系的报道。ES细胞的体外定向分化研究一直是干细胞研究领域的热点。理论上来讲,ES细胞可以分化为任何组织的细胞。目前已初步建立了心肌细胞、造血干细胞、神经细胞、内皮细胞和上皮细胞等体外分化模型。
　　近年来研究发现,通过改变ES细胞的培养条件,可使其分化为上皮样细胞。将这些ES细胞来源的上皮样细胞经过基因修饰,移植到宿主乳腺组织后可长期生存并表达外源基因的策略,为研究动物乳腺反应器的制备提供了新的思路。
　　本研究以武汉本地山羊为试验动物,通过对山羊进行超数排卵获得囊胚或桑椹胚,筛选更适合于山羊类ES细胞生长的饲养层细胞、培养基、细胞因子和传代方法,有利于山羊类ES细胞长期传代;建立山羊类ES细胞来源的上皮样细胞的培养方法,为通过转基因干/前体细胞移植途径建立动物乳腺生物反应器提供细胞来源。试验结果如下:
　　1.通过手术法获得45~60d的山羊胎儿,采用细胞法和组织块贴壁法培养山羊胎儿成纤维细胞,细胞传至20代以上,并对其增殖情况加以分析,为后期山羊类ES细胞的培养提供了饲养层细胞。
　　2.采用小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast, MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast, GEF)以及C2C12细胞作为饲养层细胞培养山羊类ES细胞。结果表明:与MEF(贴壁率为81.8％)和GEF(贴壁率为88.5％)相比,C2C12更有利于细胞贴壁(贴壁率为100％),但不利于维持细胞未分化状态,传至第3代细胞已分化完全。
　　3.采用三种方法培养山羊类ES细胞:
　　①全胚培养,当其发育为孵化囊胚后,在普通培养基中分割胚胎,以后每次都用此法传代;
　　②全胚培养,当其发育为孵化囊胚后,在10倍浓度的LIF和SCF中分割胚胎,以后每次都用此法传代;
　　③将获得的胚胎在酶中作用5~8min后,直接借助玻璃针分割胚胎。
　　结果表明:将胚胎全胚培养至孵化囊胚阶段后,在高浓度细胞因子LIF和SCF中分割ICM,更有利于维持细胞的未分化状态;该细胞能被传至第8代。
　　4.采用三种培养基培养山羊类ES细胞:
　　①20％ FBS+LIF+SCF+β-巯基乙醇;
　　②20％FBS+LIF+SCF+胰岛素+β-巯基乙醇;
　　③20％FBS+LIF+SCF+胰岛素+肝素+β-巯基乙醇。
　　结果表明:与培养基中只添加LIF和SCF(传至第4代)相比,培养基中添加肝素和胰岛素更有利于细胞的生长(传至第9代)。
　　5.对分离得到的部分山羊类ES细胞进行生物学鉴定。结果表明所分离的山羊类ES细胞具有典型的胚胎干细胞形态特征;核型正常;碱性磷酸酶染色呈阳性;RT-PCR检测表达胚胎干细胞特异性基因Oct-4和Nanog;免疫组化法检测特异性蛋白SSEA-1和Oct-4呈阳性反应;体外可以分化为上皮样细胞、空泡样细胞和心肌细胞。
　　6.将培养至3~4代的山羊类ES细胞用玻璃针分割成小团块,继续培养在GEF上,20d不传代,在GEF分泌的细胞因子的作用下,山羊类ES细胞分化为上皮样细胞,并将所获得的上皮样细胞传至第11代。这些细胞核型正常。RT-PCR检测结果表明,这些上皮样细胞表达上皮细胞特异性基因K10、K18、K14。

目录

摘要

ABSTRACT

英文缩率词表(ABBREVIATION)

第一章 文献综述

1 前言

2 胚胎干细胞的概念与特性

2.1 胚胎干细胞的概念

2.2 胚胎干细胞的生物学特性

3 胚胎干细胞的研究进展

3.1 小鼠胚胎干细胞的研究进展

3.2 人胚胎干细胞的研究进展

3.3 山羊和绵羊胚胎干细胞的研究进展

4 胚胎干细胞的培养条件

4.1 培养基

4.2 饲养层

4.3 分化抑制因子

5 胚胎干细胞的分离和培养方法

5.1 全胚培养法

5.2 ICM培养法

6 胚胎干细胞的鉴定

6.1 形态学鉴定

6.2 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性的检测

6.3 胚胎的阶段特异性细胞表面抗原(Stage-Specific Embryonic Antigens,SSEA)

6.4 全能性基因的检测

6.5 核型分析

6.6 体内分化试验

6.7 体外分化试验

6.9 嵌合体制备

7 胚胎干细胞体外分化的研究进展

7.1 心肌细胞

7.2 造血干细胞

7.3 神经细胞

7.4 上皮细胞

8 胚胎干细胞的应用前景

8.1 在临床治疗上的应用

8.2 生产克隆动物

8.3 药学研究

9 胚胎干细胞研究所面临的问题和挑战

第二章 山羊胎儿成纤维细胞的分离培养

1 材料方法

1.1 试验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器和设备

1.4 溶液的配制

2 试验方法

2.1 成纤维细胞的原代培养

2.2 细胞的传代培养

2.3 细胞的核型分析

2.4 细胞的冻存和复苏

2.5 绘制细胞生长曲线

3 结果

3.1 细胞形态观察

3.2 细胞核型分析

3.3 细胞生长曲线

4 讨论

第三章 山羊类胚胎干细胞的分离与培养

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器和设备

1.4 溶液的配制

2 试验方法

2.1 山羊的超数排卵

2.2 饲养层的制备

2.3 手术法获取山羊胚胎

2.4 山羊类ES细胞的分离培养

2.5 山羊类ES细胞的鉴定

3 结果与分析

3.1 不同的饲养层细胞对山羊类ES细胞生长的影响

3.2 不同培养方法对山羊类ES细胞传代培养的影响

3.3 不同生长因子对山羊类ES细胞传代培养的影响

3.4 山羊类ES细胞的鉴定

4 讨论

4.1 饲养层细胞对山羊类ES细胞生长的影响

4.2 ICM处理方法对山羊类ES细胞生长的影响

4.3 生长因子对山羊类ES细胞生长的影响

第四章 山羊类ES细胞来源的上皮样细胞的分离与培养

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂的配制

2 试验方法

2.1 山羊类ES细胞体外分化为上皮样细胞的培养体系

2.2 山羊类ES细胞来源的上皮样细胞系的鉴定

3 结果与分析

3.1 山羊类ES细胞体外分化为上皮样细胞

3.2 山羊类ES细胞来源的上皮样细胞的特异性基因的检测

3.3 细胞核型分析

4 讨论

第五章 小结

1 本研究获得的结果

2 本研究的创新点

3 下一步研究进展

参考文献

致谢