猪源多杀性巴氏杆菌的分子流行病学与致病性研究

摘要

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种重要的病原菌,对多种动物和人均有致病性,可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR),也是猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)的重要致病因子之一。Pm现已流行于世界养猪业发达的各个国家和地区,该病原菌可与多种病原协同感染,从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和死亡率,并造成严重的经济损失。本研究对Pm的病原流行病学、分离菌株的生物学特性、分子多样性、耐药现状、毒力和免疫原性基因进行研究,为我国Pm的流行病学研究提供理论依据,为临床上猪巴氏杆菌病的诊断、有效防控和相关的基础研究奠定基础。主要研究内容如下:
　　 1.多杀性巴氏杆菌在我国部分地区猪群中的流行现状
　　 2003～2007年对我国部分地区规模化猪场健康猪群和有肺炎与萎缩性鼻炎疑似症状猪的临床样品进行检测,结果从湖北等16个省、市、自治区2,912份有发病症兆猪的鼻拭子、肺脏、胸腔积液、心血和颈部水肿组织中分离出233株Pm,未能从725份健康猪棉拭子中分离出Pm。在我国猪群中,2003～2007年间Pm的总分离率为8.0％；不同年份Pm的总分离率介于6.4～10.2％之间。应用PCR方法对分离的Pm进行荚膜分型,结果证实,分离株中有92株(39.5％)属A型Pm,128株(54.9％)属D型Pm,1株(0.4％)属B型Pm,12株(5.2％)为未定型分离株。同时对分离的49株Pm进行致病性试验,结果高致病株、中致病株和低致病株分别占受试菌的36.7％(18/49)、49.0％(24/49)和14.3％(7/49)；对分离Pm的产毒素能力进行鉴定,结果11株产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm)均为高致病菌株,占61.1％(11/18)。
　　 2.猪源多杀性巴氏杆菌耐药表型与基因型的研究
　　 对分离的233株Pm菌株进行20种临床常用抗生素的最小抑菌浓度(MICs)试验,结果表明,分离菌株对阿莫西林、林可霉素、克林霉素、四环素和磺胺类药物不敏感,对大观霉素、卡那霉素、庆大霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物中度敏感；而头孢菌素类、氟苯尼考和氟喹诺酮类药物对Pm分离株表现出很高的活性,能有效抑制该类菌群。多重耐药性分析表明,有217株(93.1％)Pm具有多重耐药性；5耐以上的菌株有127株,占54.7％:流行最广的Pm耐药表型为:AMX+LIN+CLI+TET+SDM+STX。18种耐药基因的PCR检测证实:耐阿莫西林Pm携带blaTEM的阳性率为80.7％；耐林可酰胺类药物Pm携带ermA、ermC和lnuA的阳性率分别为36.7％、49.8％和24.0％；耐甲氧苄啶类Pm携带dfr A5、afr A7和afr A13的阳性率分别为18.5％、32.9％和29.5％；而四环素抗性主要由tet(H)、tet(B)和tet(G)介导:磺胺类抗性主要由sul1和sul2介导。分析耐药表型与基因型关系表明,同一种抗生素可由不同的耐药基因介导,多数菌株携带有不同的耐药基因,并显著的具有多重耐药性(P<0.01)。
　　 3.猪源多杀性巴氏杆菌的毒力基因型与分布特征研究
　　 对Pm的19种毒力相关基因进行PCR检测,结果证实,粘附因子ptfA(93.6％)、fimA(99.1％)、hsf-2(99.1％),转铁蛋白exbB(99.1％)、exbD(99.1％)、tonB(97.9％)、hgbA(96.6％)、fur(92.7％),唾液酸酶nanH(97.0％)和外膜蛋白ompA(100％)、ompH(93.1％)、oma87(94.4％)、plpB(99.1％)的流行与检出率较高,几乎所有的猪源Pm均携带这些毒力因子；而毒力因子pfha,tadD,toxA和pmHAS在猪源Pm菌株中的检出率均低于50％。不同的毒力因子与荚膜血清型具有一定的相关性,如tadD显著的分布于A型Pm(P<0.001)；hsf-1和nanB显著的分布于D型Pm(P<0.001)；hgbA和fur主要分布于A型和D型Pm(P<0.01)；pfha和pmHAS显著的分布于A型和未定型Pm(P<0.001)；且试验中不同地区分离的11株T+Pm的毒素toxA基因也仅分布于D型。
　　 4.猪源多杀性巴氏杆菌分离株的分子多样性研究
　　 采用RAPD,(GTG)5-PCR和Eric-PCR分析方法,对从我国不同地区分离的233株猪源Pm进行核酸分子分型和多样性分析。DNA指纹谱型表明RAPD方法的分辨率为39.48％,多态性条带的百分率为73.96％,可将受试的Pm分为92个基因型,其中有11个(比例为12.0％)为优势谱型。在相似系数为60％时,Pm分离株可被分为32个簇,其中最大的1簇含有A型Pm20株,D型Pm22株,B型和未定型Pm各1株,且遗传背景相关的16株海南省分离菌聚集在该簇；11株T+Pm也聚集在该簇。(GTG)5-PCR的分辨率为49.36％,多态性条带的百分率为88.13％,可将受试的Pm分为115个基因型,其中优势谱型有7个(比例为6.08％)。在相似系数为60％时,Pm分离株可被分为68个簇。Eric-PCR指纹分析方法的分辨率为24.46％,多态性条带的百分率为73.46％,可将受试的Pm分为57个基因型,其中优势谱型有11个(比例为19.03％)。在相似系数为60％时,Pm分离株可被分为36个簇。综上分析表明,我国不同地区分离的猪源Pm的核酸基因组存在显著的多样性,同时证明了(GTG)5-PCR和RAPD扩增的DNA指纹比Eric-PCR图谱具有更强的多样性。
　　 5.猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因的分子特征与致病性研究
　　 为分析我国产毒多杀性巴氏杆菌T+Pm地方分离株的分子特征、遗传背景及毒力特性,对分离的11株T+Pm的毒素toxA基因进行了克隆和测序。结果表明,toxA基因编码的毒素PMT是一个高度保守的蛋白,其核苷酸间的同源性达99％以上,其氨基酸的同源性达98.5％以上,且该基因在911～912和2323～2324核苷酸位点发生点突变的频率较高,达到23.8％(5/21)。对toxA基因的分子进化树分析表明,我国地方T+Pm分离株可分为2个亚群,且菌株间的亲缘关系或遗传背景较近,表现出区域相关性,与韩国、台湾、美国等分离株同属一个进化分支。对小鼠的LD50试验证实,T+Pm对小鼠具有高致病性,且分离株HN-13表现为强毒力,其对小鼠的LD50为4.25×103CFU。将HN-13株人工感染试验猪,建立T+Pm的感染模型,结果HN-13不但可复制出PAR的临床症状,且该菌株可引起猪肺炎。免疫组织化学分析证实,HN-13株感染猪的急性期,机体中大量的嗜中性白细胞发生局部聚集,以抵抗病原菌的侵入,在肺泡内同时也出现了巨噬细胞吞噬感染的T+Pm,并造成巨噬细胞的坏死和髓样病变。
　　 6.毒素PMT的N-端和C-端蛋白的生物学活性及免疫原性研究
　　 将5个toxA基因片段N1518、C2345、N3172、N3388和C2115分别克隆到合适的原核表达载体pET-28a(b,c)系统,其中pET28a-N1518和pET28b-C2115在大肠杆菌成功表达,获得大小分别为57kDa和78kDa的融合蛋白rPMT-N和rPMT-C,Western blot检测证实这两种表达产物均具有反应原性。分别以200μg rPMT-N和rPMT-C对小白鼠进行体内生物学活性试验,结果两种表达蛋白均不能致死小白鼠；体外细胞毒性试验证实896ng/ml的rPMT-N能使Vero细胞发生病变,而rPMT-C对Vero细胞无明显毒性作用。将rPMT-N和rPMT-C制成亚单位疫苗,同时设天然PMT及无菌PBS对照组,间隔2周分2次免疫小白鼠和仔猪。结果表明rPMT-N、rPMT和天然PMT试验组能诱导小鼠产生较高滴度的毒素抗体,而rPMT-C诱导的毒素抗体滴度较低；对仔猪免疫效力试验证实,rPMT-N、rPMT、rPMT-C和天然PMT均能诱导机体产生针对PMT的毒素抗体,但用1×1010CFU的HN-13株对各组试验仔猪进行鼻腔感染试验后,rPMT-C提供的保护力较rPMT-N、rPMT和天然PMT组低。综上试验表明,rPMT-N具有良好的生物学活性和免疫原性,可作为PAR疫苗添加成分,显示了良好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

缩略词(Abbreviation)

第1章 文献综述

1.1 多杀性巴氏杆菌概述

1.2 猪巴氏杆菌病的流行与危害

1.3 多杀性巴氏杆菌毒力因子的研究进展

1.4 病原菌的分子分型技术

第2章 研究的目的和意义

第3章 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、质粒和培养条件

3.1.2 工具酶和试剂

3.1.3 抗生素标准品

3.1.4 主要培养基的配制

3.1.5 主要溶液的配制

3.1.6 主要实验器材

3.1.7 实验动物

3.2 实验方法

3.2.1 病料和棉拭子样品的采集

3.2.2 病原菌的分离鉴定

3.2.3 细菌的PCR检测

3.2.4 Pm的荚膜分型

3.2.5 Pm临床分离株的致病性试验

3.2.6 Pm的药物敏感性分析

3.2.7 耐药基因的PCR扩增

3.2.8 毒力基因的PCR检测

3.2.9 Pm的分子多样性分析

3.2.10 toxA基因序列分析

3.2.11T+Pm对小鼠的半数致死性试验(寇氏(Korbor)法)

3.2.12 T+Pm鼻腔感染猪模型的建立

3.2.13 toxA基因亚克隆表达载体的构建

3.2.14融合蛋白的表达和纯化

3.2.15毒素PMT的ELISA抗体检测

3.2.16组织病理学检查

3.2.17免疫组织化学染色检查(间接法)

3.2.18 rPMT-N和rPMT-C的生物学活性试验

3.2.19 rPMT-N和rPMT-C对小鼠的免疫原性

3.2.20 rPMT-N和rPMT-C对仔猪的免疫效力试验

3.2.21统计分析

第4章 结果与分析

4.1 多杀性巴氏杆菌在我国部分地区猪群中的流行现状分析

4.1.1 健康猪群细菌的分离鉴定结果与分析

4.1.2 Pm在猪群中的分离与流行情况分析

4.1.3 猪源Pm分离株的荚膜血清型鉴定结果

4.1.4 Pm共感染菌的分离鉴定与分析

4.1.5 致病性试验结果

4.1.6 致病性与分离株来源的对比分析

4.2 多杀性巴氏杆菌分离株的耐药表型与基因型的分析

4.2.1 猪源Pm的药物敏感性

4.2.2 猪源Pm的多重耐药性

4.2.3 血清型与耐药性的关系分析

4.2.4 耐药基因在Pm分离株中的流行

4.2.5 耐药表型与基因型的相关性分析

4.3 猪源多杀性巴氏杆菌的毒力基因型与分布特征研究

4.3.1 PCR检测方法的建立

4.3.2 Pm毒力因子的检测

4.3.3 毒力因子在不同荚膜血清型的分布

4.3.4 毒力因子的相关性分析

4.3.5 毒力基因型与致病力的关系

4.4.猪源多杀性巴氏杆菌分离株的分子多样性研究

4.4.1 PCR指纹分析引物的确定

4.4.2 稳定性

4.4.3 分辨力

4.4.4 RAPD指纹分析

4.4.5 (GTG)5-PCR指纹分析

4.4.6 Eric-PCR指纹分析

4.4.7 比较分析Pm的分子多样性

4.5 产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因的分子特征与致病性研究

4.5.1 toxA基因的扩增

4.5.2 重组质粒的鉴定

4.5.3 toxA基因的序列分析

4.5.4 氨基酸推导序列的分析

4.5.5 系统进化分析

4.5.6 T+Pm对小鼠半数致死量的测定

4.5.7 毒素PMT的提纯

4.5.8 PMT的SDS-PAGE检测与Western-blot分析

4.5.9 猪抗PMT高免血清的制备

4.5.10免疫组化方法的建立与优化

4.5.11动物感染模型的建立

4.6 重组产毒多杀性巴氏杆菌毒素PMT的N-端和C-端蛋白的生物学活性与免疫原性

4.6.1 toxA基因亚克隆表达载体的鉴定及序列分析

4.6.2 重组质粒的原核表达、纯化及Western blot检测

4.6.3 ELISA毒素抗体检测方法的建立

4.6.4 rPMT-N和rPMT-C的生物学活性

4.6.5 rPMT-N和rPMT-C对小鼠的免疫效力试验

4.6.6 rPMT-N和rPMT-C对仔猪的免疫效力试验

第5章 讨论

5.1 多杀性巴氏杆菌在我国猪群中的流行现状

5.2 猪源多杀性巴氏杆菌的多重耐药性

5.3 猪源多杀性巴氏杆菌的毒力基因型与分布特征

5.4 猪源多杀性巴氏杆菌的分子分型与遗传多样性

5.5 产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因的分子特征与致病性

5.6 毒素PMI、的N-端和C-端蛋白的生物学活性及免疫原性

第6章 结论

参考文献

PUBLICATIONS

PATENT AND VETERINARY DRUGS

CURRICULUM VITAE

致谢