百合AGAMOUS同源基因的克隆、载体构建及遗传转化

摘要

百合(Lilium spp.)为多年生球根花卉，花朵硕大，花色艳丽，花姿优美，寓意百年好合，是重要的切花之一，深受人们的喜爱。但百合的花型却很单一，野生的百合原种绝大多数为单瓣花，此外，百合花粉量大，污染花瓣，十分影响美观，瓶插寿命也会大大缩短。长期以来，人们将百合花形育种视为最重要的育种目标之一，希望获得具有更高观赏价值的百合新品种。然而，在自然界突变的重瓣或无花粉百合很难找到，即使遇到这样的材料也很难将它作为育种亲本培养百合新品种，分子生物学与生物技术的发展为这些问题的快速解决提供了可能性。花发育ABC模型是近年来的研究热点，通过对拟南芥，金鱼草等模式植物的深入研究，人们已经对ABC模型有了更深层次的了解。
　　 本实验从百合品种‘西伯利亚’中克隆出了花发育C类基因LLAG，构建了该基因的超量表达载体、反义载体以及干涉载体，一方面将这三个载体转化烟草对该基因进行功能验证，同时将这三个载体转化矮牵牛，期待对矮牵牛的花型产生改变，以丰富矮牵牛的品种，并为最终转化百合获得重瓣或无花粉的百合新品种提供理论支持。实验结果如下：
　　 1.依据已发表的麝香百合花发育C类基因设计引物，从百合品种‘西伯利亚’中克隆了麝香百合花发育C类基因LLAG1的同源基因LLAG，该基因与NCBI中报道的各个百合花发育C类基因的同源性都很高，初步认定LLAG为‘西伯利亚’中控制花发育的C类基因。
　　 2.利用已克隆的LLAG基因核苷酸序列设计引物引入适当的酶切位点，利用pMV载体构建了超量表达载体和反义载体；利用pHANNIBAL和pART27构建了干涉载体，并将这三个载体转入农杆菌菌株EHA105。
　　 3.将构建好的三个载体分别转化了烟草和矮牵牛，获得阳性植株。经统计，pMV-oxLLAG转化烟草共获得49株阳性植株，pMV-anti-LLAG转化烟草共获得31株阳性植株，pA-LLAGRi转化烟草共获得21株阳性植株。pMV-oxLLAG转化矮牵牛共获得12株阳性植株，pMV-anti-LLAG转化矮牵牛共获得4株阳性植株，pA-LLAGRi转基因矮牵牛共获得6株阳性植株。
　　 4.超量表达载体转基因烟草的花器官出现三种不同类型的同源异型变化。第一种类型表现为花萼膨大，花冠筒在幼期尚未伸出花萼时即张开，花瓣皱缩不能完全张开。第二种类型的花芽花萼膨大较第一种类型更为显著，花冠筒先端呈鼓突状，花瓣向内反卷不能完全张开。第三种类型的花芽表型变化最为强烈，花萼先端细尖外向反卷，基部膨大。花瓣向内反卷且在花冠基部出现一类似花瓣的附属物。扫描电镜结果显示，转基因烟草花瓣细胞形态与野生型的花药细胞相似，有花瓣雄蕊化的倾向。RT-PCR结果证明外源C类基因能够抵制内源A类基因的表达。超量表达载体转基因矮牵牛萼片直立，花冠简明显变小。花瓣先端呈皱折状。反义载体转基因矮牵牛花色变淡，烟草表型有待观察。干涉载体转基因植株较小，有待进一步观察。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一部分 前言

1.文献综述

1.1 花发育的ABC模型及发展

1.2 百合花发育MADS-box基因研究进展

2.本课题研究的意义与技术路线

2.1 本课题研究的目的和意义

2.2 本课题研究的技术路线

第二部分 百合AGAMOUS同源基因LLAG克隆和分析

1.材料与试剂

1.1 植物材料

1.2 菌株和载体

1.3 试剂及试剂盒

2.实验方法

2.1 百合高质量RNA的提取

2.2 RNA电泳检测

2.3 RNA反转录

2.4 目的基因cDNA的扩增

2.5 目的片段的回收

2.6 目的片段与T载体的连接

2.7 连接产物的转化

2.8 重组质粒的筛选与鉴定

2.9 阳性克隆的序列测定及其分析

3.结果与分析

3.1 百合花芽总RNA的提取及检测

3.2 百合AG同源基因cDNA的RT-PCR扩增

3.3 阳性克隆的PCR鉴定

3.4 百合AG同源基因cDNA序列的获得及序列比对

3.5 百合AG同源基因的结构域分析

3.6 百合AG同源基因与近缘物种AG类基因的进化树分析

4.讨论

4.1 扩增百合花发育C类基因时花芽的选择

4.2 百合LLAG基因的序列分析

第三部分 百合AG同源基因植物表达载体的构建

1.实验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 酶及分子生物学试剂

1.3 各种实验试剂的配制

1.4 主要实验仪器

1.5 实验所需引物序列

2.实验方法

2.1 目的基因插入片段的获得

2.2 线性载体的准备

2.3 目的基因与线性载体的连接

2.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

2.5 重组质粒的筛选和鉴定

2.6 植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105及其鉴定

3.实验结果

2.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

3.2 百合AG同源基因反义载体的构建

3.3 百合AG同源基因干涉载体的构建

3.4 重组质粒转化农杆菌

4.讨论

4.1 载体构建方法的比较

4.2 干涉效果的预测

第四部分 百合AG同源基因LLAG的转化

1.实验材料

1.1 菌种和转化植物材料

1.2 化学试剂配制

1.3 引物设计

1.4 培养基配制

2.实验方法

2.1 外植体选择

2.2 矮牵牛的组织培养

2.3 烟草的组织培养

2.4 根癌农杆菌介导法转化矮牵牛

2.5 根癌农杆菌介导法转化烟草

2.6 转基因植株的鉴定

2.7 超量表达载体转基因烟草阳性植株的分析

3.实验结果

3.1 转基因植株的获得

3.2 T0代转基因植株的PCR检测

3.3 超量表达载体转基因植株的分析

3.4 反义载体转基因植株表型分析

3.5 干涉载体转基因植株表型分析

4.讨论

4.1 超表载体转基因植株表型变化分析

4.2 外源C类基因影响烟草内源基因的表达

参考文献

致谢