长江草鱼群体MHC ClassⅡB基因的克隆、表达及多态性分析

摘要

主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是在脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群，并且其某些基因型与生物体抗病能力存在一定的关联关系。本研究以我国重要淡水养殖经济鱼类草鱼为实验材料，利用PCR、RT-PCR等技术研究了MHCⅡB基因的克隆、表达、等位基因的多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系，为筛选抗病相关MHCⅡB基因标记和建立基因标记辅助选育技术提供基础。
　　 (1)克隆及测序了草鱼长江3个群体的主要组织相容性复合体(MHC)ClassⅡB基因编码β1和β2区的第2和第3个外显子及两个外显子之间的内含子，分析了草鱼MHC的进化模式和种群遗传结构。结果共定义了34个等位基因，每条序列包括长为130～136bp的第2个外显子，长为218bp的第3个外显子以及长81～371bp的内含子。序列分析揭示，第2个外显子有106个核苷酸变异位点(78％)和40个氨基酸变异位点(88％)，而第3个外显子有100个核苷酸变异位点(45％)和41个氨基酸变异位点(56％),β1变异要大于β2区。用邻接法(NJ)分别构建的βi和β2序列系统树均获得5个高支持率的谱系，结合序列变异特点和内含子长度，推测草鱼至少存在5个MHCClassⅡ座位。分别计算βi的肽结合位点(PBR)、非肽结合位点及β2的非同义替换率(dN)和同义替换率（ds），结果显示PBR的dN/dS为2.03(p＜0.05)，非肽结合位点和β2则小于1，表明草鱼MHC受到歧化选择作用。根据不同群体中MHC等位基因分布频率的分子方差分析(FST=0.37％)，长江草鱼群体间无遗传分化。
　　 (2)用嗜水气单胞菌感染健康草鱼，分别在感染5h、16h、40h、64h、88h、112h时收集草鱼各组织材料提取总RNA，另取健康草鱼组织作对照。以反转录合成的第一链cDNA为模板，应用RT-PCR半定量检测方法对草鱼感染嗜水气单胞菌前后的MHCⅡB基因组织表达特点进行了研究。结果表明，在正常草鱼组织中，除脑组织以外，MHCⅡB基因均扩增出约350bp的片段，MHCⅡB基因较强的表达于肾脏、心脏和肠中，中等程度表达于肝脏、脾脏和鳃中，在肌肉中表达最弱。嗜水气单胞菌感染后，在草鱼的肝脏、肾脏、心脏、肠和鳃组织中，感染初期MHCⅡB基因表达量都有所下降，而在感染88h的时候MHCⅡB基因表达量在所有时间点中达到最大，感染112h后表达量慢慢回落至正常值；其中肠组织在112h时，MHCⅡB基因表达水平依旧较高。脾脏在感染后，表达量总体处于上升趋势，88h时表达量达到最大值，112h后慢慢回落至正常值。

目录

文摘

英文文摘

第1章 文献综述

1 MHC的发现

2 MHC的结构和功能

3 MHC分子进化特点

3.1 高度多态性

3.2 连锁不平衡

3.3 基因倍增与重组

4 MHC在渔业上的应用

4.1 脊椎动物适应性免疫系统的分子进化

4.2 种群及生态遗传学

4.3 抗病与遗传育种

5 本研究的目的、意义和研究思路

第2章 长江草鱼群体MHC ClassⅡB基因的表达、多态性和进化分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验仪器、试剂及溶液的配制

1.3 总DNA的提取

1.4 草鱼总RNA的提取

1.5 总RNA的消化(RQ1 RNase-Free DNase, Promega)

1.6 第一链cDNA的合成(M-MLV Reverse Transcriptase, Promega)

1.7 半定量RT-PCR

1.8 目的基因的克隆

1.9 数据分析

2 结果与分析

2.1 序列的多态性

2.2 选择压力检测

2.3 等位基因的系统关系

2.4 种群遗传结构

2.5 用RT-PCR检测草鱼MHC ⅡB基因的表达

3 讨论

3.1 草鱼MHC ClassⅡB基因的进化模式

3.2 种群变异及应用意义

3.3 草鱼MHCⅡB的表达分析

参考文献

硕士期间完成的论文

致谢