草鱼出血病转基因植物疫苗表达载体的构建

摘要

草鱼（Ctenopharyngodonidellus）是我国重要的淡水养殖品种之一，在我国淡水渔业生产中占有举足轻重的地位。草鱼出血病是草鱼鱼种阶段最为严重的疾病，死亡率高达90％以上，造成重大的经济损失。目前对该病尚缺乏有效的防治方法。
　　 转基因植物疫苗是一种高新技术疫苗。利用现代分子克隆技术、植物基因工程技术与免疫学技术，构建外源基因植物表达载体并导入植物体内，表达外源基因编码的抗原蛋白，通过口服途径免疫，使人体或和动物获得特异性免疫能力。和其它传统疫苗相比，具有廉价、安全、有效等优点。目前，越来越多的人类与动物重大疾病病原的抗原蛋白在植物中得到了表达，有的已进入了动物和人体实验。
　　 本研究的主要研究任务是：构建表达草鱼出血病呼肠孤病毒VP6抗原蛋白的植物表达载体和培育植物胚性愈伤组织并进行分化，以期为草鱼出血病转基因植物疫苗研究奠定前期基础。本论文主要进行了以下几个方面的研究：
　　 1.根据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6抗原蛋白的全基因序列(GeneBankAF403394)设计特异性引物，采用RT-PCR技术扩增编码GCRV-VP6抗原蛋白的1.3Kbp读码框片段，将VP6基因编码片段与pCR2.1载体连接，经酶切、PCR扩增和序列测定确认正确后，再将其克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中。酶切、PCR扩增和序列测定显示，pCAMBIA1302-VP6含有1.3Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段，表明GCRV-VP6抗原基因已正确插入植物表达载体pCAMBIA1302中，成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。
　　 2.根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874)设计并合成特异性引物，从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板，进行RT-PCR扩增，得到约1.3Kbp的GCRVVP6基因读码框片段，同时提取大肠杆菌H44815全基因组作为模板，PCR扩增得到约370bp的LTB基因读码框片段。将获得的两目的片段分别克隆到pCR2.1载体上，经酶切、PCR扩增检测和序列测定确认正确后，将其克隆到携带绿色荧光蛋白标记的植物表达载体pCAMBIA1302上，成功构建了可将草鱼呼肠孤病毒VP6抗原蛋白、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、绿色荧光蛋白融合表达的植物载体pCAMBIA1302-LTB-VP6。本研究为草鱼出血病可饲化转基因植物疫苗研制奠定了基础。
　　 3.以黑麦草(Loliumperenne)成熟胚为外植体材料，进行外植体的灭菌、愈伤组织的诱导、继代及植株再生。诱导出可以用于组织培养的黑麦草胚性愈伤组织。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 草鱼出血病

1.1 草鱼出血病的研究简史

1.2 草鱼出血病的症状及流行情况

1.3 草鱼呼肠孤病毒的生物学特性

1.4 草鱼出血病的防治方法

2 转基因植物可食性疫苗研究

3 渔用转基因植物疫苗研究

4 LTB基因及黑麦草遗传转化的研究

4.1 LTB基因研究

4.2 黑麦草遗传转化研究

五 植物表达载体PCAMBIA1302

第二章 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白植物表达载体的构建

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1.2 实验材料与试剂

1.3 所用软件

1.4 实验方法

2 结果与分析

2.1 病毒滴度测定结果

2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

2.3 GCRV VP6蛋白编码基因的克隆与鉴定

2.4 pCAMBIA 1302-VP6阳性重组质粒的鉴定

第三章 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基融合植物表达载体的构建

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.2 目的基因片段的PCR引物设计及扩增

1.3 重组质粒pCR2.1-VP6和pCR2.1-LTB构建

1.4 pCAMBIA1302-LTBNP6植物融合表达载体的构建

2 结果与分析

2.1 GCRVVP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基编码基因的克隆及测序

2.2 pCAMBIA1302-LTBNP6阳性重组质粒的酶切和PCR鉴定

2.3 pCAMBIA1302-LTBNP6植物融合表达载体构建图

3 讨论

第四章 黑麦草愈伤组织培养及遗传转化

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1.2 材料

2 方法

2.1 黑麦草愈伤组织培养

2.2 农杆菌工程菌种制备

2.3 农杆菌介导黑麦草的遗传转化

3 结果

3.1 黑麦草愈伤组织的诱导

3.2 黑麦草愈伤组织分化

3.3 阳性重组质粒转化农杆菌

3.4 农杆菌介导重组质粒转化黑麦草愈伤组织

4 讨论

4.1 转化受体的选择

4.2 菌液浓度

4.3 侵染方式与侵染时间

4.4 共培养时间

结语

参考文献

致谢