同时检测多种环境激素污染物的液相免疫芯片技术研究

摘要

近些年来,研究发现一些存在于环境中的化学物质具有类似内分泌激素的作用,可以导致生物体内分泌系统紊乱,因此将这类物质统称为环境激素(EnvironmentalEndocrine,EE)。EE在环境中分布广泛且多为脂溶性的有机小分子,化学性质特别稳定,在体内和体外都不易分解,通过食物链进入生物体内后,可蓄积于脂肪组织内,从而对人和其他生物体的生殖与发育系统、免疫系统及神经系统等造成伤害。目前,EE已威胁到人和动物的生殖健康甚至物种的繁衍。
　　 为了保护生态环境,预防环境激素污染物(Environmental Endocrine Pollutants,EEP)通过食物链进入人体,发展灵敏、快速及成本低的分析检测技术是非常必要的。目前,EEP主要使用GC-MS、HPLC及LC-MS来进行分析与确证,但是存在样品前处理过程复杂、操作繁琐、仪器昂贵、检测成本偏高等缺点,不能很好地满足日常分析及现场检测的需求。而免疫学方法由于具有灵敏度高、特异性强、操作方便和成本低等优点,已被应用于EEP的日常分析检测,特别适用于对大量样品进行分析筛选。然而目前多数免疫分析方法通常一次实验仅能分析一种EEP,而样品中往往是同时存在多种EEP。因此发展效率更高的能对样品中的多种EEP同时分析的免疫学方法是目前拟解决的关键问题。
　　 本研究以双酚A(Bisphenol A,BPA)、2,4-滴(2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D)及毒死蜱(Chlorpyrifos,CHI)三种典型的EEP为分析对象,在构建BPA、2,4-D与CHI完全抗原与制备抗BPA抗体的基础上,采用Luminex技术建立了能同时分析上述三种EEP的LIA,并与酶联免疫吸附检测方法(ELISA)和HPLC进行了比较分析。具体的研究内容如下。
　　 1.完全抗原的制备
　　 本研究采用活性酯法分别制备BPA、2,4-D及CHI的完全抗原偶联物。经质谱分析表明BVA-BSA、2,4-D-BSA及CHI-BSA的摩尔偶联比分别为15:1、22:1和11:1。
　　 另外首次采用Mannich法将BPA与阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)偶联,构建了完全抗原BPA-cBSA,产物经质谱分析其摩尔偶联比为14:1。
　　 2.BPA抗体的制备
　　 以BVA-BSA和BPA-cBSA分别免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,完全抗原均能有效地产生抗BPA的抗体,BPA-cBSA组抗血清效价高于BVA-BSA组。上述结果表明,小鼠对BPA-cBSA的免疫应答水平显著高于BVA-BSA。
　　 3.BPA、2,4-D及CHI的ELISA研究
　　 3.1间接竞争ELISA
　　 以上述自制的抗BPA抗体与购买到的抗2,4-D及CHI抗体为材料,分别建立了检测BPA、2,4-D与CHI的间接竞争ELISA,绘制它们的ELISA标准曲线,其线性范围分别为40～1289、34～1914与38～234 ng/mL,半抑制率(IC50)分别为177、366及108 ng/mL,最低检出限(LOD)分别为16、3与8 ng/mL。
　　 将不同浓度的BPA(400、100和25 ng/mL)、2,4-D(800、200和50 ng/mL)及CHI(200、100和50 ng/mL)分别添加于空白的自来水和河水中,BPA、2,4-D与CHI的平均加标回收率分别为68％～142％、55％～135％及90％～108％,平均变异系数分别为6％～15％、6％～14％及3％～12％。
　　 3.2 BPA的半抗原直接包被ELISA研究
　　 在建立了检测BPA的间接竞争ELISA的基础上,建立了检测BPA的半抗原直接偶联ELISA(dhc-ELISA),绘制其dhc-ELISA标准曲线,其线性范围为2～157 ng/mL,IC50及LOD约为23.5及0.3 ng/mL。
　　 将不同浓度的BPA(250、50和10 ng/mL)分别添加于空白的自来水和河水中,以建立的dhc-ELISA进行检测,结果显示平均回收率与平均变异系数分别为60％～132％及6％～13％。
　　 4.BPA、2,4-D及CHI的液相芯片技术研究
　　 经条件优化后,分别绘制了BPA、2,4-D和CHI的间接竞争Luminex标准曲线,检测区间分别为0.8～246.1、5.4～391.1及14.2～364.9 ng/mL,IC50值分别为30.8、64.0及98.3ng/mL,LOD值分别约为0.03、O.35及0.16 ng/mL。
　　 在建立了检测三种靶标物的Luminex方法的基础上,为了全面考察液相芯片多通道检测实际样品的能力,添加BPA(10、50及150 ng/mL)、2,4-D(20、100及300 ng/mL)及CHI(30、150及450 ng/mL)标准品于空白的河水或自来水中分别配制成18种不同组份样品。结果表明,当样品中仅含有一种靶标物时,BPA、2,4-D及CHI在水样中的平均加标回收率分别为41％～132％、64％～147％及52％～109％,平均变异系数分别为0.8％～8.7％、0.3％～9.6％及1.7％～8.8％。当样品中两种靶标物同时存在时,BPA、2,4-D及CHI在水样中的平均加标回收率分别为52％～123％、51％～121％及64％～97％,平均变异系数分别为0.9％～9.9％、0.6％～6.0％及0.8％～5.8％。当样品中三种靶标物并存时,BPA、2,4-D及CHI在水样中的平均加标回收率分别为43％～66％、62％～112％及51％～68％,平均变异系数分别为3.2％～5.5％、1.1％～0.3％及2.2％～7.1％。上述结果表明Luminex法能够较好对样品的多靶标物进行同时分析。

目录

文摘

英文文摘

部分英文缩略词

第一章 文献综述

1 环境激素污染物

1.1 引言

1.2 环境激素污染物的来源

1.3 环境激素污染物的种类

1.4 环境激素污染物的危害

1.5 环境激素污染物的分析方法

2 液相悬浮芯片免疫分析的研究进展

2.1 液相悬浮芯片免疫分析的发展历史

2.2 液相悬浮芯片免疫分析原理

2.3 液相悬浮芯片免疫分析的优点及面临的问题

2.4 液相悬浮芯片技术的发展方向

2.5 液相悬浮芯片技术的应用

2.6 结论

3 本研究的目的意义与内容

3.1 研究目的和意义

3.2 研究内容

第二章 完全抗原与抗体的制备

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 BPA完全抗原的制备与鉴定

2.2 2,4-D蛋白偶联物的制备与鉴定

2.3 CHI蛋白偶联物的制备与鉴定

2.4.抗体的鉴定

3 讨论

3.1 关于阳离子载体蛋白的作用

3.2 小分子蛋白偶联物的制备与鉴定

3.3 抗体的特异性研究

第三章 ELISA研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果和分析

2.1 常规ELISA研究

2.2 半抗原直接偶联ELISA研究

2.3 两种ELISA的比较研究

3 小节与讨论

3.1 影响ELISA参数的因素

3.2 半抗原直接偶联ELISA

第四章 液相芯片检测方法的研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 荧光微球的形态观察

2.2 包被原与羧基荧光微球的偶联确证

2.3 液相芯片检测条件的优化

2.4 环境激素污染物检测的悬浮芯片标准曲线

2.5 特异性实验

2.6 有机溶剂对微球的荧光漂白实验

2.7 多通道检测实验

2.8 加标回收实验

3 讨论

3.1 抗体及SA-PE的浓度

3.2 检测模式

3.3 理化因素对IC50值的影响

第五章 方法比对研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果和分析

2.1 环境激素污染物HPLC检测

2.2 加标回收率

2.3 环境激素污染物高通量悬浮芯片检测法与其它方法的比较

3 小结和讨论

第六章 结论与展望

1 主要结论

1.1 制备了BPA的抗体,建立了检测环境中BPA残留的ELISA

1.2 建立了检测环境中BPA残留的半抗原直接偶联ELISA

1.3 制备了2,4-D的包被原,建立了检测环境中2,4-D残留的ELISA

1.4 制备了CHI的包被原,建立了检测环境中CHI残留的ELISA

1.5 制备了BPA包被原与荧光微球的偶联物,建立了检测环境中BPA残留的Luminex方法

1.6 制备了2,4-D包被原与荧光微球的偶联物,建立了检测环境中2,4-D残留的Luminex方法

1.7 制备了CHI包被原与荧光微球的偶联物,建立了检测环境中CHI残留的Luminex方法

1.8 建立了同时检测环境中BPA、2,4-D及CHI残留的Luminex方法

1.9 方法比对研究

2 展望

2.1 在抗体制备方面

2.2 在ELISA研究方面

2.3 在Luminex免疫分析研究方面

3 创新点

参考文献

致谢

附 攻读博士学位期间发表的论文