利用酵母双杂交技术研究流感病毒NS2蛋白与宿主蛋白的相互作用

摘要

流感病毒的NS2蛋白具有核定位信号，可分布在宿主细胞核内，符合常规酵母双杂交技术对诱饵的要求。NS2在各种亚型的A型病毒中都比较保守，能介导病毒核蛋白复合体(vRNP)的核输出过程。相对流感病毒的其它蛋白质来说，NS2的研究显得比较薄弱。本研究以期发现一些与NS2相互作用的宿主因子，拓展现有的流感病毒与宿主相互作用网络，为阐述流感病毒的的致病机制，提出新的疾病防控思路提供帮助。
　　 酵母双杂交技术作为一种高通量手段，已应用于流感病毒蛋白与宿主蛋白质的相互作用研究。本论文以该方法为平台，以NS2为诱饵，从人胎脑cDNA文库中筛选与其互作的蛋白，研究互作可能的生物学功能。主要研究内容如下：1)用禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)NS2蛋白为诱饵，从人的胎脑cDNA文库中寻找与之相互作用的蛋白质将NS2克隆在诱饵pGBKT7载体上，转化AH109酵母，在确定NS2没有自激活现象后，利用AH109和Y187酵母可接合生殖的特性，将pGBKT7-NS2(+)AH109与含人胎脑cDNA文库的Y187酵母混合培养，经过三轮筛选最终得到10个候选阳性克隆。2)GSTpull-down对相互作用进行体外验证将NS2克隆到pGEX-6P-1载体上，原核表达得到GST-NS2并进行纯化。将10个猎物基因克隆到pET-32a载体上，得到HIS-Preys。在表达过程中发现，NS2能可溶性表达，10个猎物只有6个有明显的可溶性表达，它们分别是：stathmin样蛋白2(STMN2)，DDB1andCUL4相连因子6(DCAF6)，含铜离子代谢所需结构域的蛋白(COMMD1)，驱动蛋白家族的成员C2(KIFC2)，真核转录延伸因子1的α亚基1(EEF1A)，微管关联蛋白1B(MAP1B)。
　　 用这6个可溶性表达的蛋白进行GSTpull-down实验，结果表明stathmin样蛋白2(STMN2)与NS2有相互作用，提示流感病毒感染对宿主细胞形态的影响可能与NS2有关。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

1 文献综述

1.1 禽流感病毒分类及命名

1.1.1 禽流感病毒血清型分类

1.1.2 禽流感病毒亚型分类

1.1.3 依据致病性分类

1.1.4 命名规则

1.2 禽流感病毒的理化特性

1.2.1 病毒组份

1.2.2 理化因素对流感病毒的影响

1.3 禽流感病毒的基因组及其编码蛋白

1.4 禽流感病毒的形态和结构

1.5 流感病毒的增殖过程

1.6 流感病毒非结构蛋白NS1和NS2的功能

1.7 酵母双杂交技术介绍

1.7.1 酵母双杂交技术原理

1.7.2 酵母双杂交技术平台的应用

1.7.3 传统酵母双杂交技术的缺点

1.8 哺乳动物双杂交系统

1.9 GST Pull-down技术介绍

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株、菌株

2.1.2 酵母双杂交文库与氨基酸

2.1.3 载体

2.1.4 抗体

2.1.5 酶类

2.1.6 抗生素

2.1.7 酵母双杂交用药品、试剂

2.1.8 培养基

2.1.9 质粒提取及DNA电泳用试剂及溶液

2.1.10 酵母质粒营救所需溶液

2.1.11 SDS-PAGE电泳用试剂及溶液

2.1.12 Western blot缓冲液及试剂

2.1.13 其他药品

2.1.14 重要仪器和设备

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.3 病毒RNA的提取

2.2.4 反转录病毒基因组

2.2.5 PCR扩增NS2片段

2.2.6 DNA片段的回收

2.2.7 PCR回收产物、载体双酶切

2.2.8 连接反应

2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.10 连接产物的转化与单克隆的扩大培养

2.2.11 碱裂解法小量提取质粒

2.2.12 重组质粒的验证

2.2.13 酵母双杂交

2.2.14 原核表达

2.2.15 GST pull-down

3 结果

3.1 利用酵母双杂交技术从人的胎脑cDNA文库筛选与NS2相互作用的配体

3.1.1 诱饵质粒构建

3.1.2 AH109酵母菌株表型验证

3.1.3 诱饵质粒pGBKT7-NS2转入AH109及自激活验证

3.1.4 pGBKT7-NS2对AH109毒性的检测

3.1.5 评价文库滴度

3.1.6 酵母的接合效率

3.1.7 阳性克隆的质粒提取

3.1.8 酵母双杂交系统的回转验证

3.1.9 进一步排除假阳性

3.1.10 阳性克隆的测序结果

3.2 GST pull-down进一步验证相互作用

3.2.1 pET32a-Preys克隆

3.2.2 NS2原核表达与纯化

3.2.3 HIS-preys表达

3.2.4 GST pull-down验证猎物蛋白STMN2与NS2的相互作用

4. 讨论

4.1 NS2作为诱饵的可行性

4.2 候选猎物阳性克隆的剔除

4.3 GST pull-down进一步验证互作情况

5 总结

参考文献

简历

致谢