2个融合启动子在马铃薯中低温诱导块茎特异表达功能研究

摘要

薯片和薯条等加工产品的生产在马铃薯加工业中占有重要位置。为了抑制常温贮藏导致的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等现象及延长加工周期，常将块茎在低温条件下贮藏。但低温会导致还原糖的累积，而还原糖在高温油炸时会与自由氨基酸发生褐化反应，严重影响了加工产品的品质。由于低温下还原糖积累代谢途径的复杂性，所以常规育种效率很低，基因工程已成为改良该性状的主要途径之一。
　　 为了增强转基因植物的目标性，避免外源基因过度表达而产生负面影响，低温诱导的块茎特异表达启动子成为马铃薯块茎品质改良的迫切需要。本研究在2个具有低温诱导活性的块茎特异表达融合启动子之后连接900bp反义酸性转化酶，构建了由两个启动子驱动的反义转化载体pCL-900和pCLM1b-900，拟比较2个融合启动子驱动的反义酸性转化酶基因表达对转化酶活性及转基因马铃薯块茎还原糖含量的影响。研究评价融合启动子pCL与pCLM1b在马铃薯基因工程中潜在的应用价值，同时筛选抗低温糖化转基因系，为进一步揭示马铃薯块茎的低温抗性机制和改良马铃薯的加工品质奠定基础。主要研究结果如下：
　　 1．对实验室已有的农杆菌试管薯切片遗传转化体系进行了优化。分别在激素水平、农杆菌浓度、侵染时间和共培养时间4个因素对遗传转化效率的影响进行了研究。实验通过单因素优化后，再进行正交试验，确定了当IAA浓度为0.4mg/L，农杆菌浓度为OD值0.6，侵染时间9min.，共培养时间在40-48h之间时，农杆菌介导的转化效率最高。
　　 2．采用上述优化的遗传转化体系，将pCL-900和pCLM1b-900转入马铃薯中，获得转基因植株。再生植株PCR检测结果证明，pCL-900共获得12个转基因株系，pCLM1b-900共获得3个转基因株系。
　　 3．融合启动子驱动的转化酶基因反义片段在转基因株系中不同程度地抑制了转化酶活性。15个转基因株系的块茎低温贮藏后，除pCL-900-7外，其余转基因株系的转化酶活性均不同程度地低于对照品种E3。4℃贮藏30天的转化酶活性分析显示，pCL-900-1、pCL-900-3、pCL-900-4、pCL-900-5、pCL-900-6、pCL-900-8、 pCL-900-10、pCL-900-11、pCLM1b-900-1、pCLM1b-900-2、pCLM1b-900-3等11个系的转化酶活性显著或极显著低于受体品种。
　　 4．与受体品种比较，4℃贮藏条件下，转基因株系转化酶活性的降低幅度在30％以上，还原糖含量的降低幅度为20%-36%，二者的相关程度达到极显著水平。但株系间存在较大差异，在贮藏30天后，pCL-900-10和pCLM1b-900-1降幅最高，其酸性转化酶活性降幅分别62.1%和58.4%，还原糖含量下降幅度分别为51.4%和64.8%。研究结果初步证明，所采用的块茎特异低温诱导启动子能有效启动基因在低温贮藏块茎中的表达，反义DNA酸性转化酶途径能在一定程度上改良马铃薯块茎抗低温糖化的性状。