猪链球菌2型感染宿主后宿主表达谱的分析研究

摘要

猪链球菌病是由猪链球菌(Streptococcus suis)引起的一种重要的细菌性传染病,属国家规定的二类动物疫病。猪链球菌属于革兰氏阳性菌,目前根据荚膜多糖(CPS)可将猪链球菌分为33个血清型。其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)流行最广、致病力最强,是一种重要的人畜共患传染病,能引起包括人和猪在内的多种动物的多种疾病,造成感染甚至死亡,严重影响养猪业的发展和人类健康。感染猪链球菌2型菌能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎等病变,并造成突然死亡。人通过接触病死猪及其副产品经伤口、消化道感染猪链球菌2型,可引起人链球菌中毒休克综合症(STSS)和链球菌脑膜炎综合症(SMS),导致脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎、永久性耳聋及突发性死亡等,死亡率高。1998年夏季,在我国江苏省部分地区爆发了人感染猪链球菌病造成14人死亡；2005年夏季,在四川省的大爆发,造成204人发病38人死亡,引起了全球对公共卫生的关注。
　　 败血症是SS2感染的常见的症状,并且能引起高死亡率。研究发现SS2可以天然寄居在扁桃体中而不发病,但是在一定的条件下SS2进入血液,被单核细胞吞噬或单独存在血液中,通过脉络丛运送到脑脊液(CSF)中,激发单核细胞或吞噬细胞产生高水平的细胞因子和趋化因子,导致该部位的炎症反应和脑膜炎。为了研究SS2感染宿主后与宿主单核细胞的相互作用,本研究选择人单核细胞FHP-1细胞,采用基因芯片的方法研究SS2感染对人THP-1细胞的基因表达谱的变化。
　　 由于SS2感染猪和人之后主要导致脑膜炎、肺炎以及败血症等病理变化,为了深入了解其致病机制,本实验选择人工感染SS2的猪脑组织、肺组织以及外周血单核淋巴细胞(PBMC)为研究对象,采用基因芯片的方法研究SS2感染后其基因表达谱的变化,为进一步研究感染机制和致病机理提供依据。具体内容如下:
　　 1.人单核细胞系THP-1细胞感染SS2后表达谱的变化用SS2感染THP-1细胞3h,收集对照组和实验组THP-1细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,然后在体外(IVT)合成cRNA,将cRNA片段化后与AffymetrixGenChip@系列的Human Genome U133 plus2.0基因芯片进行杂交,通过洗片、扫描得到表达谱芯片的各探针的信号值。通过分析,得到感染了SS2的THP—1细胞的各个基因,相比较没感染SS2的THP-1对照细胞,基因的表达量是否发生了变化,以及变化的倍数(Fold Change,FC)。本实验以p-value小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因为上调,p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因为下调。经过统计学分析,在此芯片中包含的38500个人的基因中,有2021个转录本p-value小于或等于0.05,筛选出386个转录本有显著性差异表达变化的基因,通过DAVID在线软件分析,根据Gene Ontology(GO)的注释,328个基因是已知的,包括了230个上调基因和98个下调基因。
　　 通过对这些基因进行Gene Ontology生物学过程(Biological process)分类,差异表达基因较多地参与下述生物学过程:翻译(Translation)、细胞因子(Chemokine)、防御/免疫反应(Defese/immunity)、泛素.蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasomesystem)、细胞分裂(Cell division)、凋亡(Apoptosis)、信号转导(signal transduction)、代谢(metabolism)、信号转导(Signal transduction)、转录(Transcription)及代谢(Metabolism)等。
　　 利用STRING在线软件分析这些差异表达基因合成的蛋白之间的功能关系,并对一些蛋白之间的关系进行预测。我们筛选出以INSR、BCL2、CTNNB、UBE2D1和TIF2为中心的网络关系图,主要围绕在NF-kappa-B信号通路及其他免疫反应途径相关的调控网络中。
　　 进一步用实时荧光定量PCR方法对其中5个相关基因:同源盒基因(homeoboxA4,HOXA4)、CC类趋化因子受体8(chemokine(C-C motif)receptor8,CCR8)、羧肽酶O(carboxypeptidase O,CPO)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位2(RNA polymeraseⅡsubunit2,POLR2B)、丙酮酸脱氢酶Elα亚单位基因(pyruvate dehydrogenase(lipoamide)alpha1,PDHA1)、Janus激酶1(Janus kinase1,JAK1)的表达差异进行了验证,得出HOXA4、CCR8、CPO分别上调2.56、32.94和30.96倍,POLR2B、PDHA1为无变化的0.87和0.76倍,JAK1则下调0.48倍。而Human Genome U133 plus表达谱芯片筛出的这几个差异表达基因分别为7.297、7.775、10.52、1、1和0.477倍,与Realtime PCR的结果基本保持一致。
　　 2.人工感染SS2的猪脑组织、肺组织及外周血单核淋巴细胞的表达谱变化用SS2感染仔猪,24小时后宰杀,取得对照组和实验组仔猪的脑组织、肺组织及全血分离获得的PBMC。提取总RNA,反转录成cDNA,然后在体外(IVT)合成cRNA,将cRNA片段化后与Affymetrix GenChip@系列的Porcine Genome基因芯片进行杂交,通过洗片、扫描得到表达谱芯片的各探针的信号值,通过分析得到感染了SS2的猪的脑、肺及PBMC,相比较没感染SS2的脑、肺及PBMC,基因的表达量是否发生了变化,以及变化的倍数(Fold Change,FC)。本实验以p-value小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因为上调,p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因为下调。经过统计学分析,在此芯片中包含的20201个猪的基因中,脑组织中总共检测到1608个有显著性差异表达变化的基因,包含了344个上调和1264个下调。肺组织中检测到617个有显著性差异表达变化的基因,包括293个上调和324个下调。PBMC中共检测到685个有显著性差异表达变化的基因,包括403个上调和282个下调。在3个组织中均有有显著性差异表达变化的基因有31个,包括了26个上调基因和5个下调基因。
　　 利用DAVID(Visualization and Integrated Discovery)在线软件分析,共检测到脑中417个已知的基因。在肺中共检测到210个已知的基因,在PBMC中检测到213个已知的基因。将这些检测到的基因进行分类,可以知道差异表达基因主要集中在以下几个类别,包括:防御反应(defence response)、免疫反应(immune response)、炎症反应(inflammatory response)、天然免疫(innate immune rsponse)、细胞粘附(cell adhesion)、细胞死亡(cell death)、细胞分化(cell differentiation)、与信号传导关联的细胞表面受体(cell surface receptor linked signal transduction)、细胞因子活性(cytokine activity)、细胞因子结合(cytokine binding)、对外界刺激的反应(response to external stimuli)、对刺激的反应(response to stimulus)、应激反应(response to stress)、创伤反应(response to wounding)、信号转导活性(signaltransducer activity)、基因表达(gene expression)和生长因子活性(growth factoractivity)。
　　 进一步用实时荧光定量PCR方法对其中5个相关基因:ICAM-1、TLR2、CD163、TTR、VEGFA的表达差异进行了验证。得到结果ICAM-1、TLR2、CD163在脑中上调表达6.00、19.89、179.61倍,TTR和VEGFA下调-10.92和-4.205倍,而PorcineGenome表达谱芯片筛出的这几个差异表达基因分别为5.77、3.86、8.91、-12.83和1.55倍。在肺中,上调基因ICAM-1、TLR2、CD163的表达分别为55.50、25.59和11.30倍,TTR和VEGFA下调-7.69和-3.45倍,而表达谱芯片筛出的这几个基因分别为1.97、2.44、4.25、-1.05和-2.22倍。在PBMC中,ICAM-1、TLR2、CD163的表达量分别为上调了13.13、8.57、3.39倍,TTR和VEGFA无明显变化为-0.69和-1.27倍,而表达谱芯片筛出的这几个基因分别为3.16、2.70、9.08、-1.07、-2.71倍。与基因芯片的结果相比较,两种方法检测到的基因的表达趋势基本一致。肺中检测到的ICAM-1和TTR,以及脑中的VEGFA的表达数量与基因芯片所得的结果有一些差异,但变化趋势相同,表明芯片的结果可信。