人用禽流感(H5N1)全病毒灭活疫苗的生产工艺条件研究

摘要

流感的发病率一直以来居高不下，它所引起的并发症非常严重,导致死亡率较高。据世界卫生组织（WHO）发布的公告，全球每年人流感病例为6亿～12亿，死亡50～100万人，自1878年Perroncito首次报道了意大利的鸡感染禽流感至今，禽流感呈世界性流行。H5N1禽流感病毒突破种间障碍感染人，大流行性流感无法预测。WHO预言，下一次流感大流行不是有和无的问题，而是早和晚的问题。因此，做好大流行流感疫苗研发和关键技术平台的研究，已成为世界各国应对流感大流行采取的重大举措。目前，高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亚洲，特别是印尼、越南和中国，对其分离的毒株进行血清学、致病性和基因结构等分析表明，高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度变异的特性，就中国分离的毒株就存在南北之分。因此，WHO要求各国开展大流行流感原型疫苗的研究。接种疫苗是预防和控制流感病毒感染的唯一有效途径。武汉生物制品研究所开发的“人用大流行性流感疫苗”，是以H5N1禽流感病毒NIBRG-14疫苗株进行生产的,疫苗研发、生产工作中，产业化规模生产工艺尤为重要。
　　本论文针对人用禽流感（H5N1）全病毒灭活疫苗产业化规模生产过程中的工艺进行了大量研究：比较了细胞培养（MDCK细胞）和鸡胚培养禽流感（H5N1）病毒， MDCK细胞培养最高可达到约8.00lgTCID50/ml，但其不稳定且其宿主细胞DNA残留难以获得生产文号，因此最终确定了以传统的鸡胚为病毒培养基质；采用不同感染剂量的病毒接种9～10日龄鸡胚，分别研究了病毒感染剂量、病毒EID50与血凝滴度的关系。每个剂量分别取0.1ml、0.2ml接种鸡胚,分别在感染病毒24小时、48小时、72小时、96小时收获鸡胚尿囊液，根据病毒 EID50和血凝滴度结果确定了最佳病毒感染剂量为103 EID50、0.1ml／胚；确定了最佳收获时间为56～72h；为减少灭活剂对病毒免疫原性的影响,对甲醛灭活病毒的灭活剂量及最佳灭活时间进行了选择,将甲醛溶液稀释后分别加入至大流感病毒液，使甲醛终浓度分别为1：5000、1：10000、1：20000。混匀后放入4℃冰箱，分别在第1至第7天每天取样，然后进行灭活验证试验，依据灭活后HA结果确定了最佳灭活剂（甲醛）的最佳灭活浓度为1／10000、最佳灭活时间为144h；根据鸡胚尿囊液的特性，选用0.45+0.22μm的滤芯进行微滤，既可去除病毒尿囊液中鸡胚碎片和大分子的杂质，又达到了除菌过滤的效果；根据病毒分子本身的物理性质和相关文献，选择300KD的膜包进行超滤；比较了离心纯化法和柱层析纯化法，离心法选用蔗糖密度梯度离心，柱层析纯化法选用Sepharose4 Fast Flow凝胶层析，根据纯化数据及回收率确定了纯化工艺。因此，本论文优化了人用禽流感（H5N1）全病毒灭活疫苗产业化规模生产的工艺。

目录

声明

英 文 缩 略 词 表

1前 言

1.1高致病性禽流感（H5N1）与流感大流行

1.2 国内外该制品研究、上市现状

2目的与意义

3材料与方法

3.1实 验 材 料

3.1.1 生产用鸡胚

3.1.2 毒种

3.1.3 细胞

3.1.4主要仪器

3.1.5 主要试剂及试剂盒

3.1.6 主要试剂的配置

3.2实 验 方 法

3.2.1 病毒的接种（使用Rame-hart自动接种机接种病毒） 3.2.1.1 接通高效层流罩电源通风20min以上。

3.2.2 病毒培养

3.2.3 病毒收获（使用Rame-hart自动收获机收获病毒）

3.2.4 血液凝集测定HA滴度(HA)

3.2.5 血凝抑制试验（HI）

3.2.6 无菌实验

3.2.7 支原体检测

3.2.8 流感病毒血凝素含量测定(SRID)

3.2.9 内毒素含量检测

3.2.10 异常毒性检测

3.2.11 总蛋白含量的测定

3.2.12 卵清蛋白含量的测定

4 实 验 结 果

4.1 H5N1禽流感病毒NIBRG-14株在MDCK细胞上的培养

4.1.1 MDCK细胞生长曲线

4.1.2 不同MOI值下H5N1禽流感疫苗株在MDCK细胞上的培养观察

4.2 鸡胚生产病毒原液

4.2.1确定合适的病毒感染剂量

4.2.2 最佳收获时间

4.2.3 灭活剂最佳灭活剂量、最佳灭活时间的选择

4.2.4 微滤、浓缩及纯化工艺

4.2.5病毒的鉴定

4.2.6 工艺验证

4.2.7 人用大流行流感全病毒灭活疫苗半成品

4.2.8 分装人用大流行流感全病毒灭活疫苗成品

5 讨论与分析

6 结论

参考文献

致谢