东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析

摘要

东方巴贝斯虫(Brabesia orientalis)是一种蜱传性血液原虫,由镰形扇头蜱经卵传播,仅对水牛致病。该病主要在我国长江以南地区发生和流行,临床症状主要为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等,严重时导致死亡,对我国的水牛养殖业造成重大的经济损失。尽管本实验室已经对东方巴贝斯虫的形态学、流行病学、生活史、诊断方法以及分子分类学等进行了较为详细的研究,但仍缺乏快速高效、敏感特异、实时定量的检测方法,同时关于东方巴贝斯虫基因组的研究也未有报道。
　　 为此,本研究首先建立了东方巴贝斯虫反向线性斑点杂交(RLB)技术,并利用该方法对中国湖北地区水牛、梅花鹿和南非比勒陀利亚的绵羊和山羊血液样品的血液原虫进行了鉴定和流行病学调查；随后建立了东方巴贝斯虫环介导恒温扩增(LAMP)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法,并利用这两种方法分别对湖北地区的水牛的东方巴贝斯虫进行了流行病学调查；利用东方巴贝斯虫阳性血清对东方巴贝斯虫cDNA文库进行免疫筛选,克隆和表达了3个免疫相关基因；对东方巴贝斯虫基因组进行了序列测定和初步分析；克隆、注释了东方巴贝斯虫的线粒体基因组,并对该基因组进行了多态性分析。
　　 (1)东方巴贝斯虫反向线性斑点杂交(RLB)检测方法的建立与应用利用巴贝斯虫和泰勒虫18S.rRNA的v4高变区两端的保守区设计一对属特异性引物RLB-F和RLB-R(Gubbels et al.,1999),并根据东方巴贝斯虫(B.orientalis)18SrRNA基因v4高变区设计特异性探针,建立东方巴贝斯虫RLB检测方法,运用建立的方法对采自中国湖北省9个不同地区的304份水牛血液样品进行了检测,结果表明,感染湖北地区水牛的梨形虫有4种,分别是水牛泰勒虫、东方巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫,其阳性率分别是19.1％(58),8.9％(27),1％(3)和0.7％(2)；用RLB检测了采自湖北省的24份梅花鹿血样、南非比勒陀利亚的82份绵羊和244份山羊血样。结果表明,梅花鹿、绵羊和山羊样品都没有任何巴贝斯虫的杂交信号,三种样品的泰勒虫阳性率分别是29.20％(7/24)、28.0％(23/82)和0.8％(2/244)。多序列比对和系统进化分析表明,可能存在鹿的泰勒虫新种,南非样品结果显示犀牛泰勒虫(T.bicornis)和黑貂泰勒虫未定种(T.sp.sable)探针的特异性探针与分离泰勒虫(T.separata)等羊的泰勒虫的18S rRNA相似度极高,探针的特异性较低,存在交叉反应。
　　 (2)B.orientalis环介导恒温扩增(LAMP)检测方法的建立依据东方巴贝斯虫18S rRNA的v4高变区,用LAMP引物设计专用软件,设计4条识别目的片度6个特异性位点的引物,建立东方巴贝斯虫LAMP快速诊断方法。特异性试验表明,LAMP仅能扩增东方巴贝斯虫的DNA模板,而与其他的梨形虫DNA无任何特异性扩增。用该方法检测77份长江以南、88份长江以北的水牛血液样品和66份非洲水牛样品。结果表明,南非水牛样品全部阴性,77份长江以南和88份长江以北的样品,LAMP检测的阳性分别是24份和6份,半巢式PCR检测的阳性分别是12份和1份。检测结果表明本研究成功建立了特异性高、敏感性强、快速简便的东方巴贝斯虫LAMP检测方法,流行病学调查和统计分析显示,本试验建立的LAMP方法比此前报道的半巢式PCR更敏感,且东方巴贝斯虫已经从长江以南流行到长江以北。
　　 (3)B.orientalis实时定量检测方法的建立利用东方巴贝斯虫18S rRNA的v4高变区设计TaqMan实时定量PCR的引物和探针,建立东方巴贝斯虫的实时定量PCR检测方法(TaqMan real-time PCR)。该方法的检测极限是每微升2个虫体,特异性试验表明仅东方巴贝斯虫DNA有特异性的扩增曲线。用实时定量PCR和RLB分别检测180份湖北地区的水牛血液样品。结果表明,两种方法分别检测的阳性样品分别为28份和21份,其中长江以北分别检出16份和12份阳性；阳性样品的染虫率范围是2.0×105～2.0×100,其中有16份的染虫率为2.0×100～2.0×102。试验结果表明所建立的实时定量PCR方法能有效、定量检测东方巴贝斯虫。
　　 (4)B.orientalis免疫相关基因的克隆表达利用东方巴贝斯虫阳性血清筛选东方巴贝斯虫cDNA文库,共得到18个阳性克隆子,经EST序列分析,挑选其中的3个可能与免疫相关的基因:B04——核动蛋白基因、B05——假定蛋白基因和B41——热休克蛋白70基因(HSP70),克隆各自的ORF,分别构建原核表达载体pET-32a-B04,pET-28a-B05和pET-32a-B41,在RosettaTM中高效表达,表达产物经纯化后western blot分析,结果表明三个基因都有良好的抗原性,且证明了HSP70在东方巴贝斯虫中的存在。HSP70基因的核苷酸序列进化分析表明东方巴贝斯虫是一归属于巴贝斯虫的独立新种。
　　 (5)B.orientalis基因组测序本试验对东方巴贝斯虫基因组采用的Pair-end双末端测序进行了Solexa测序。共获得23,898,916个读长,测序数据量为2,389,891,600,测序深度约为306.5倍。剔除污染和低质量的读长,组装拼接后共获得1284个Scaffold,总长度为7,796,224bp,GC含量42.4％,与已发表的牛巴贝斯虫T2B株基因组GC含量41.8％相一致。结合本试验分析的结果和已报道的牛巴贝斯虫和小泰勒虫基因组信息,分析东方巴贝斯虫有4条染色体,基因组大小约为7.9 Mb。由于真核生物基因组非常复杂,而且目前所能参考的梨形虫基因组信息相对有限,对东方贝斯虫基因组的具体注释还有待进一步研究。
　　 (6)B.orientalis线粒体基因组(mitochondrion DNA,mtDNA)克隆和多态性分析根据基因组测序的高通量序列和cDNA文库钓取的部分mtDNA序列,结合NCBI公布的顶器门血液原虫mtDNA序列,选择其保守区设计引物,克隆东方巴贝斯虫mtDNA并做多态性分析。测序结果用Staden package软件进行拼接,Artemis_v11对东方巴贝斯虫的mtDNA进行注释。结果表明,东方巴贝斯虫mtDNA与已报道的巴贝斯虫和泰勒虫mtDNA相似,也含有3个编码区,即细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ),细胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)和细胞色素b(cytochrome b,Cytb),其大小分别为1428bp,687 bp和1092 bp,其中COXⅠ位于正义链,COXⅢ和Cytb均位于反义链上。mtDNA的COXⅠ、Cytb以及COXⅠ和Cytb结合序列的系统进化分析结果表明三种序列得到的结果与18S rRNA基因和热休克蛋白70(HSP70)基因进化分析的结果一致,即东方巴贝斯虫归属于巴贝斯虫分支。东方巴贝斯虫mtDNA的多态性分析发现其有99个多态性位点。
　　 本研究建立的东方巴贝斯虫反向线性斑点杂交(RLB)、环介导恒温扩增(LAMP)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法为进行东方巴贝斯虫病的分子流行病学调查以及反刍动物血液原虫新虫种的发现及潜在风险评估等提供了条件；东方巴贝斯虫基因组的测定和初步分析则为深入研究东方巴贝斯虫奠定了基础。