猪DDX3X的功能分析及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

摘要

DDX3X是含DEAD-box家族的RNA解旋酶成员之一。DEAD-box解旋酶参与许多的生物学过程,如:调节转录、RNA剪切、核运输、控制mRNA的翻译等。研究表明DDX3X参与天然免疫应答,增强抗病毒物质的产生；另一方面,DDX3X有可能是病毒达到天然免疫逃避的目的的手段之一。
　　 PRRSV是一种单股正链RNA病毒,属于动脉炎病毒科属,引起PRRS,给世界养猪业造成了极大的损失。生产有效的PRRSV疫苗是养猪业迫切的需求。目前还不清楚猪DDX3X的功能及其对PRRSV增殖的影响,鉴于此,本研究主要是分析猪DDX3X的功能及其对PRRSV增殖的影响,主要研究内容如下:
　　 1.猪DDX3X基因的扩增、序列分析、及进化树的绘制
　　 通过对猪基因EST数据库的分析,设计特异性引物,PK-15细胞RNA为模板,RT-PCR扩增获得猪DDX3X基因序列。分析发现猪DDX3X的核苷酸序列全长为1986bp,编码662个氨基酸,与鼠、人、牛、鸡、日本血吸虫的氨基酸序列同源性分别为97％、97％、98％、90％、53％,系统进化树分析虽然表明不同物种DDX3X的氨基酸序列存在一定差异,但是DDX3X在进化上还是比较保守的,并且猪DDX3X与牛DDX3X的亲缘关系最近。
　　 2.猪DDX3X的亚细胞定位
　　 将猪DDX3X基因插入真核表达载体pEGFP-C2中构建猪DDX3X与EGFP融合的真核表达质粒pEGFP-C2-DDX3X,转染PK-15细胞后发现猪DDX3X主要定位于胞浆,没有发现猪DDX3X在细胞核中的定位。
　　 3.猪DDX3X参与IFN-β诱导
　　 以猪DDX3X的真核表达质粒pCAGGS-HA-DDX3X转染PK-15细胞,通过荧光定量检测证实猪DDX3X能上调IFN-β-mRNA水平的表达。进一步利用猪DDX3X的干扰分子sipDDX3X干扰细胞内源性猪DDX3X的表达,检测猪DDX3X对SeV/poly(dA:dT)诱导IFN-β的影响,结果猪DDX3X的敲除明显下调SeV/poly(dA:dT)诱导的IFN-βmRNA水平。利用双荧光素酶检测系统证实猪DDX3X能显著激活IFN-β启动子。
　　 4.猪DDX3X以剂量依赖的形式促进TBK1/IPS-1激活IFN-β启动子
　　 利用红荧光蛋白和绿荧光蛋白作标记证实猪DDX3X与TBK1/IPS-1在PK-15细胞中均存在共定位现象,由此说明猪DDX3X与TBK1/IPS-1存在相互作用。进一步利用双荧光素酶检测系统证实猪DDX3X促进TBK1/IPS-1激活IFN-β启动子,并呈剂量依赖的形式,也进一步证实了猪DDX3X与TBK1/IPS-1存在相互作用。
　　 5.猪DDX3X与PRRSV的相互作用
　　 将pEGFP-C2-DDX3X真核表达质粒转染Marc-145细胞,然后接种PRRSV,DAPI染色后用激光共聚焦显微镜观察证实PRRSV感染不改变猪DDX3X在Marc-145细胞中的定位。在SJPL细胞中瞬时表达猪DDX3X,用绝对定量和TCID50检测发现猪DDX3X抑制PRRSV的增殖,进一步实验发现PRRSV能够上调PAM细胞中猪DDX3X的表达。