针对gG基因的牛传染性鼻气管炎病毒新型检测方法的建立和应用

摘要

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rrhinotracheitis viruses,IBRV)引起的牛的一种以上呼吸道炎症为主的,急性、热性、接触性传染病,临床表现以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱为主要特征。本课题组前期研究建立了gG缺失的IBRV标记疫苗株,因此,本研究旨在建立配套的鉴别诊断方法。以奶牛IBRV-gG为靶基因设计引物,建立PCR鉴别检测方法；截短克隆表达和纯化了奶牛IBRV-gG基因,制备了IBRV-gG单克隆抗体与多克隆抗体,建立了检测牛IBRV-gG的双抗体夹心ELISA方法,同时对一株IBRV-gG单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,建立了检测奶牛IBRV-gG的竞争ELISA方法。论文的主要结果如下:
　　 1.牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立
　　 根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gG基因设计特异性引物,建立了一种PCR技术,可快速检测牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV),又可同时区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病毒。
　　 2.牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白基因的截短表达
　　 根据GenBank中已发表的IBRV gG基因序列(GenBank登录号:NC_001847.1),利用计算机软件辅助筛选出gG抗原性强且不含疏水区和信号肽的区域,并用DNAstar软件设计1对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒基因组DNA为模板,PCR扩增gG基因,克隆到T载体pMD18-T,通过酶切分析及测定序列鉴定正确后,亚克隆至原核表达载体pET-32a。
　　 3.抗牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白单克隆抗体及多克隆抗体的制备
　　 用纯化的IBRV和IBRV-gG重组蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的表达蛋白、IBRV野毒株和缺失IBRV-ΔgG分别包被酶标板进行间接ELISA法筛选,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得分泌抗IBRV野毒株的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。Western-blot试验证明此单抗能特异性地与IBRV反应,与gG缺失IBRV-ΔgG不反应,用小鼠腹水生产的McAb的ELISA效价为1:51200。此单克隆抗体可以用于IBRV的鉴别检测,为我国牛传染性鼻气管炎控制计划的实施提供了工具。
　　 4.牛传染性鼻气管炎IBRV-gG检测夹心ELISA方法的建立
　　 将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3D6,1E8和1F4三株可以稳定分泌抗IBRV-gG特异性单抗的杂交瘤细胞株,用纯化的IBRV免疫新西兰大白兔,按常规方法制备IBRV多抗。选用抗gG单抗3D6株包被ELISA板,用兔抗IBRV多抗作为捕获抗体,建立了IBRV双抗体夹心ELISA检测方法。用该ELISA方法分别检测IBRV、牛分支杆菌、牛支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性。
　　 5.牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-gG抗体检测竞争ELISA方法的建立
　　 用牛传染性鼻气管炎病毒gG基因片段原核表达产物免疫小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗3D6建立了竞争ELISA,旨在检测IBRV抗体。经实验确定抗原包被浓度为500ng/mL,待检血清最佳稀释度1:160,酶标单抗3D6工作浓度1:2000,牛传染性鼻气管炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。