拮抗植物病原真菌的海洋细菌筛选及其活性物质研究

摘要

对危害严重并难以控制的农作物病原真菌,急需寻找高效新型活性物质。在陆地寻找概率越来越低的情况下,本研究以油菜菌核病和棉花枯萎病病原真菌为指示菌,对1021株海洋细菌进行了抗菌筛选,从中得到了144株具抗菌活性的菌株,并对部分活性较好的假单胞菌株产活性物质进行了分子检测,同时详细研究了筛选得到的具有稳定拮抗油菜菌核病的海洋假单胞菌YZSN25和拮抗水稻纹枯病的海洋粪产碱杆菌WL24。分别对其抗作物病原菌谱,拮抗活性物质的分离、纯化和初步鉴定以及发酵培养条件进行了研究,结果如下:
　　 (1)在筛选的168个属中,活性菌株筛得率最高的属分别是芽胞杆菌属和假单胞菌属。筛选的1021株海洋细菌中包括海洋假单胞属菌株302株,得到了50株有活性的假单胞菌株。其中以不同来源的铜绿假单胞菌菌株筛选拮抗活性几率和拮抗活性最高。同时对筛选得到的部分活性较强的19株假单胞菌进行了活性物质的分子检测,分子检测结果显示:菌株1A06832和SH-46扩增获得了2,4-DAPG合成基因的目的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321扩增获得了吩嗪合成基因的目的片段；1A06832、1A00318和SH-46扩增获得了藤黄绿脓菌素合成基因的目的片段；而硝吡咯菌素合成基因片段没有获得。
　　 (2)筛选得到的海洋菌YZSN25,经生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定初步确认属于假单胞菌(Pseudomonas sp.),具体的种仍需进一步实验确定,菌株连续传代10次遗传稳定性良好,其抑菌谱结果显示对油菜菌核病菌、水稻纹枯病、玉米小斑病菌、小麦赤霉菌、棉花立枯等植物病原真菌有较强的抑制作用。
　　 (3)菌株YZSN25活性物质理化性质研究表明:对热具有良好的稳定性,对酸碱不敏感,在酸性条件下可形成沉淀,复溶后仍然具有原来的活性；经紫外、蛋白酶、有机溶剂处理都显示了较好的耐受性。硫酸铵盐析活性组分分子量介于30 kDa-100 kDa之间,活性物质经固相萃取初步分离,由薄层层析实验进一步分离纯化,经水和茚三酮显色法初步确定为环脂肽类活性物质,同时获得两条Rf值分别为0.13(a)和0.29(b)的活性带,活性组分后又经高效液相色谱和质谱联用初步推测活性物质a和b可能为相同分子量的一类新型环脂肽类活性物质,其具体的分子量和结构有待进一步确定。
　　 (4)菌株YZSN25发酵培养基条件单因素优化实验初步确定了发酵条件组合:培养基初始pH值为自然pH值,种子液接种菌龄为12 h,接种量为3.0％,250 mL发酵摇瓶装液量为60 mL,发酵时间48 h,发酵温度28℃,摇床培养振荡频率为180r/min。对油菜菌核病离体叶片防治实验表明:活性物质粗提物的浓度为100μg/mL时对油菜菌核病的防治效果达到87.7％。
　　 (5)筛选得到海洋菌WL24,经生理生化鉴定和16S rRNA基因分析鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis),经连续传代10次抑菌活性稳定,其抑菌谱实验表明对水稻纹枯病、柿子炭疽病、玉米小斑病及蔬菜灰霉病等多种植物病原真菌有较强拮抗效果。
　　 (6)菌株WL24活性物质的理化性质研究结果表明:对热不具有较好的稳定性,60℃以上处理30 min活性下降迅速,对酸碱敏感在中性环境中较为稳定,对紫外处理敏感,经紫外光照射30 min时活性即下降37.2％,经蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后,其相应的抑菌活性分别下降了31.6％、23.9％和21.3％。经测定活性物质在发酵周期为24 h达到最大值,而且抗菌活性的产生并不需要高浓度氯化钠的诱导。活性物质经硫酸铵盐析沉淀、凝胶过滤层析以及蛋白胶实验初步分离确定为分子量为40kDa左右的蛋白。抗菌蛋白的生防实验及结构鉴定和抗菌机理的研究等相关工作有待进一步研究。