利用固定化真菌Rhizopus sp.LG04连续还原Cr(Ⅵ)的研究

摘要

由于铬及其化合物在工业领域的广泛使用，使其大量地以气体、液体和固体的形式进入环境中，产生了严重的生态环境和健康问题。在铬污染废水中，Cr(VI)的毒性最强，约为Cr(III)的100倍，且最难去除。因此，将可溶的Cr(VI)还原为毒性较低的Cr(III)，是现阶段治理铬污染废水的有效方法之一。由于有些微生物具有吸附或还原Cr(VI)的能力，且在自然界中含量丰富易于分离培养，使它们在铬污染的治理中具有很大的潜力，越来越受到人们的广泛关注。其中，细菌除铬的研究主要集中在对Cr(VI)的还原方面，真菌主要是综合对Cr(VI)的吸附和还原两个方面来达到治理铬污染的目的,其研究没有细菌的深入。
　　本课题从湖北大冶铁山矿等的污染土壤中筛选出30株Cr(VI)还原真菌和10株Cr(VI)还原细菌，并利用形态学及ITS(Internal Transcribed Spacers)，18S rRNA，16S rRNA基因序列等方法，对它们进行初步分类鉴定。利用菌株在含 Cr(VI)培养基中的生长，对菌株的Cr(VI)还原效果进行了测定。其中真菌菌株Trichophyton sp. LG12, Trichophyton sp. LG14, Trichoderma sp. LG15, Hypocrea sp. LG16, Trichoderma sp. LG17, Colletotrichum sp. LG21在含Cr(VI)初始浓度为0.8 mM的改良马丁培养基中生长3天时，对 Cr(VI)的还原效率均可达到90%以上，细菌菌株 Streptomyces sp. LG37在含Cr(VI)初始浓度为2 mM的TSBY培养基中生长28 h时对Cr(VI)的还原效率可达到100%，细菌Streptomyces scabiei sp. HS5在含Cr(VI)初始浓度为0.8 mM的 TSBY培养基中生长24 h时对 Cr(VI)的还原效率可达到100%。另一株真菌Rhizopus sp. LG04虽然对Cr(VI)的还原效率比上述菌株稍低(70.78%)，但菌丝体和孢子发达。因此，将上述9菌株作为本课题固定化除铬研究的重点菌种资源，并对它们进行固定化除铬的固定化包埋试验。结果发现菌株Rhizopus sp. LG04孢子的包埋固定化小球在稳定性上为最好，其余菌株菌体均易从包埋固定化小球中泄漏。
　　本研究重点对游离真菌 LG04还原 Cr(VI)和固定化 LG04孢子小球连续还原Cr(VI)及其还原机制进行了研究。经过形态学及ITS和18S rRNA基因序列分析，该菌株被确定为根霉菌(Rhizopus)，编号为Rhizopus sp. LG04。LG04菌株具有10 mM的 Cr(VI)抗性，在好养条件下生长并进行 Cr(VI)的还原。游离的 Rhizopus sp. LG04在改良马丁培养基中生长4.5天可将0.8 mM的Cr(VI)完全还原。通过扫描电镜、能谱扫描和透射电镜等方法对 LG04还原 Cr(VI)的机制进行的初步研究，发现菌株LG04对Cr(VI)的还原机制可能包括两部分：第一，LG04菌体可能分泌一种或几种还原性物质(可能包括酶类)到菌体细胞外，参与对Cr(VI)的还原；第二，菌体表面的官能团吸附并将Cr(VI)还原为Cr(III)，然后将Cr(III)释放到水体环境中。其中第一个方面在Cr(VI)的去除中起主要作用。
　　为了将Rhizopus sp. LG04的除铬能力应用于含铬污水的治理中，对菌体的包埋固定化材料及比例进行了多次试验，最终得到了利用3%聚乙烯醇(PVA，w/v)和3%海藻酸钠(SA，w/v)的包埋剂制备而成的LG04固定化小球在50%改良马丁培养基中连续还原Cr(VI)的体系。固定化的Rhizopus sp. LG04小球在不补充营养条件的50%改良马丁培养基中，可连续4次将0.8 mM的Cr(VI)持续还原，还原效率依次为100%，98.11%，85.68%和72.5%。在更换新鲜含0.8 mM Cr(VI)的50%改良马丁培养基条件下，固定化的Rhizopus sp. LG04小球可重复利用，进行高达30个循环以上的Cr(VI)还原，第一个循环在第5天时可将Cr(VI)彻底还原，随着循环次数的增加，Cr(VI)还原速率也逐渐增加，从第15个循环开始，每次还原添加的0.8 mM Cr(VI)仅用2.5天。在第19、22、27、30次循环的开始和结束时测得溶液的pH值从6.5-6.7下降到了3.7-4.0。pH值的降低，可能是LG04对Cr(VI)的还原所致，而酸性环境进一步增强了菌体表面质子化的官能团捕获Cr(VI)阴离子的能力。通过扫描电镜和光学显微镜观察证实了LG04孢子可以在固定化小球中萌发生长，这也是固定化LG04小球能够持续还原Cr(VI)的基础。另外，本研究采用的3%PVA和3%SA的包埋剂组合，不仅固定化材料组成简单、廉价、无毒，固定化小球单位体积内包埋的生物量更大，固定化牢固，重复利用性好，而且固定化Rhizopus sp. LG04小球具有良好的机械强度和化学稳定性，这都为它的持续循环利用提供了有力的前提条件，预示了其在实际中巨大的应用潜力。

目录

声明

缩略名词表(Abbreviations)

1前言

1.1铬污染及危害

1.2 铬污染的传统处理方法

1.3 生物法处理铬污水及机制的研究

1.4 固定化微生物除Cr(VI)的研究

1.5 研究目的与技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 Cr(VI)还原菌的筛选及初步鉴定

3.2 菌株Rhizopus sp.LG04的分类鉴定

3.3 游离菌株LG04对Cr(VI)的还原效率

3.4 真菌LG04在还原Cr(VI)过程中菌丝体的变化

3.5 LG04固定化孢子对Cr(VI)的还原

3.6 LG04固定化小球的重复使用效率

3.7 LG04固定化小球处理含Cr(VI)培养基前后的变化

4 讨论

5 结论与展望

参考文献

致谢

附录