抑制素对小鼠卵泡发育和精子发生的分子细胞调控机制研究

摘要

抑制素是由性腺所分泌的糖蛋白质激素，与激活素一起调控垂体促卵泡素(FSH)合成和分泌，进而调控卵泡发育和精子发生，影响动物的生殖能力。
　　 本研究通过分析抑制素在第一波精子发生过程中的mRNA和蛋白的时空表达谱，研究了抑制素在精子发生中的作用，并以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreenplasmid为载体，以抑制素α亚基基因(Inha)作为研究抑制素功能的候选基因，构建了三对Inha RNAi重组质粒，通过转染小鼠颗粒细胞和支持细胞，研究了抑制素对两种细胞的发育调控作用机制及与卵泡发育和精子发生相关基因的表达作用，并用卵巢直接注射法研究了重组质粒对卵巢组织作用研究。为抑制素研究卵泡发育和精子发生机制奠定了基础，并对人类生殖调控的研究有重要的借鉴作用，为以后开发促进精子发生、卵泡发育、提高超数排卵、人工孪生，转基因动物的新技术有重要的指导意义。研究内容和结果如下：
　　 1、小鼠睾丸第一波精子发生过程中抑制素mRNA和蛋白时空表达规律
　　 分别提取1d、7d、10d、14d、21d、28d、35d、56d雄性小鼠睾丸组织总RNA和总蛋白，利用Real Time PCR分析了Inha，Inhba和Inhbb基因在指定时间段的相对表达水平和Western Blot分析了INHA蛋白在指定时间段的表达水平，发现：
　　 (1)Inha mRNA在1d时的表达量均显著高于在7d、10d、14d、21d、28d、35d、56d时期的表达量，28d之后表达水平较低；
　　 (2)Inhba和Inhbb mRNA的表达量显著低于同时期Inha mRNA的表达量，第28d除外；
　　 (3)INHA蛋白在1d，7d，14d和21d的表达水平明显高于28d，35d和56d的表达水平，而且从28d开始至56d INHA蛋白的表达水平维持在一个较低的水平。
　　 结果表明，抑制素在第一波的精子发生过程中与后续精子发生过程中的作用因表达的差异有所不同，特别是在圆形精子出现之前，抑制素有重要调控作用。
　　 2、抑制素RNAi对体外培养小鼠睾丸支持细胞生长发育和精子发生相关基因表达的作用
　　 构建了pshRNA-1、pshRNA-2和pshRNA-3共3个Inha RNAi重组质粒，转染至支持细胞，应用Real-Time PCR，Western blot分析了转染48h后RNAi的效果，筛选出抑制效果最好干扰组，应用Real-Time PCR，Western blot和流式细胞术研究抑制素对支持细胞细胞周期和精子发生相关基因表达的影响，发现：
　　 (1)RNAi可显著降低小鼠支持细胞目的基因的表达量，pshRNA-1、pshRNA-2、pshRNA-3均可显著降低Inha的mRNA和蛋白表达水平，其中以pshRNA-2重组质粒干扰效果最为显著，对Inha mRNA的抑制率为58%；
　　 (2)Inha RNAi后，小鼠支持细胞Inhba，Inhbb，Dhh和Tip1 mRNA表达量上调，Pdgfa和Kitl mRNA表达量下调；
　　 (3)Inha RNAi后，小鼠支持细胞INHBA，INHBB和P21蛋白的表达量上调；CyclinD1和CyclinE蛋白的表达量下调；
　　 (4)Inha RNAi后，S期的小鼠支持细胞比例显著减少，G1期的小鼠支持细胞比例显著增加：
　　 结果表明，抑制素通过调控支持细胞的细胞周期(G1至S期的过渡期)，影响其生长发育，并且抑制素与支持细胞表达的与精子生成有关的基因Dhh，Tip1，Pdgfa和Kitl的表达有影响。
　　 3、抑制素RNAi对小鼠卵巢颗粒细胞的生长发育调控作用及其机制研究
　　 用pshRNA-1、pshRNA-2和pshRNA-3共3个Inha RNAi重组质粒，转染至颗粒细胞，应用Real-Time PCR，Western blot分析了转染48h后RNAi的效果，筛选出抑制效果最好干扰组，应用Real-Time PCR，Western blot和流式细胞术研究抑制素对颗粒细胞凋亡、细胞周期和卵泡发育相关基因表达的影响，发现：
　　 (1)RNAi可显著降低小鼠颗粒细胞目的基因的表达量。pshRNA-1、pshRNA-2、pshRNA-3均可显著降低Inha的mRNA和蛋白表达水平，其中以pshRNA-2重组质粒干扰效果最为显著，对Inha mRNA的抑制率为60%；
　　 (2)Inha RNAi后，小鼠颗粒细胞Inhba，Inhbb，P450scc，P450arom，Bax，Ar和Caspase-3 mRNA表达量上调，Bcl2和Tgfbr3 mRNA表达量下调；
　　 (3)Inha RNAi后，小鼠颗粒细胞INHBA，INHBB和P21蛋白的表达量上调；
　　 (4)Inha RNAi后，小鼠颗粒细胞凋亡增加；
　　 (5)Inha RNAi后，S期的小鼠颗粒细胞比例显著减少；
　　 结果表明，抑制素在TGFp作用通路中有重要的调控作用，抑制素亚基之间存在自动调节机制，而且推测抑制素调控颗粒细胞的生长是通过调节Bcl2家族基因表达的变化，而诱导Caspase-3激活细胞凋亡通路实现的。
　　 4、小鼠卵巢注射法研究抑制素RNAi质粒的表达
　　 本研究利用实验第三章中所筛选的沉默效率最高的pshRNA-2重组质粒，应用卵巢直接注射法成功使其在卵巢组织表达并且对小鼠的卵巢发育状态和产仔能力没有影响，为体内研究抑制素作用机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略词表

第一章 文献综述

1 抑制素研究进展

1.1 抑制素简述

1.2 抑制素分子结构特征

1.3 抑制素对生殖活动的调节及其作用机制

1.4 抑制素对雌性动物生殖的影响

1.5 抑制素对雄性动物生殖的影响

2 卵泡发育中分子和细胞的调控机制研究

2.1 细胞表达的相关生长因子的调控作用

2.2 卵巢细胞增殖分化在卵泡发育过程中作用

3 精子发生的分子和细胞调控机制研究

3.1 精子发生的过程

3.2 精子发生的基因表达调控

3.3 睾丸支持细胞在精子发生中的作用

4 研究目的与意义

第二章 小鼠睾丸第一波精子发生过程中抑制素mRNA和蛋白时空表达规律

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计分析

3 结果与分析

3.1 睾丸组织总RNA质量

3.2 Inha，Inhba，Inhbb在睾丸发育不同时间的相对表达量分析

3.3 INHA蛋白在睾丸发育不同时间的表达量分析

4 讨论

5 小结

第三章 抑制素RNAi对体外培养小鼠睾丸支持细胞生长发育和精子发生相关基因的作用

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计分析

3 结果与分析

3.1 Inha RNAi重组质粒酶切及测序鉴定

3.2 Inha RNAi重组质粒转染小鼠支持细胞

3.3 支持细胞总RNA质量

3.4 Inha RNAi重组质粒的效果鉴定

3.5 Inha沉默影响支持细胞细胞周期

3.6 Inha沉默对支持细胞相关蛋白表达的影响

3.7 Inha沉默对支持细胞相关基因mRNA表达的影响

4 讨论

4.1 抑制素RNAi效果显著

4.2 抑制素对支持细胞周期的调控

4.3 抑制素与精子发生相关基因的表达作用

5 小结

第四章 抑制素RNAi对小鼠卵巢颗粒细胞中生长发育机制的研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计分析

3 结果与分析

3.1 Inha RNAi重组质粒转染小鼠颗粒细胞

3.2 颗粒细胞总RNA质量

3.3 Inha RNAi重组质粒的效果鉴定

3.4 Inha沉默诱导颗粒细胞凋亡

3.5 Inha沉默影响颗粒细胞周期

3.6 Inha沉默对颗粒细胞相关蛋白表达的影响

3.7 Inha沉默对颗粒细胞相关基因mRNA表达的影响

4 讨论

4.1 抑制素RNAi效果显著

4.2 抑制素调控颗粒细胞生长发育机制

4.3 抑制素的分子调控

4.4 抑制素与类固醇合成

5 小结

第五章 小鼠卵巢注射法研究抑制素RNAi质粒的表达

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计分析

3 结果与分析

3.1 卵巢组织总RNA质量

3.2 GFP在手术后卵巢组织表达分析

3.3 手术后小鼠卵巢发育的检测

3.4 Inha在手术后卵巢组织不同时间的相对表达量分析

4 讨论

5 小结

结论

研究创新点与不足

参考文献

发表的主要论文

致谢