微囊藻毒素在不同氧浓度下的细胞毒性及其促细胞增殖机理的初探

摘要

蓝藻水华及其产生的藻毒素对水生生物，野生动物和人类产生了极大的危害，其中微囊藻毒素(MCs)是最常见的蓝藻毒素。大量实验证明微囊藻毒素具有很强的肝特异性毒性并且是一种潜在的促癌剂。MCs的致毒机制之一是能强烈的抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性导致蛋白磷酸化增加，这与其促癌活性有直接关系。氧化应激是藻毒素另一个重要的致毒机制，与氧浓度有着密切的联系。目前关于藻毒素的研究有很多，包括:肝毒性，肾毒性，遗传毒性，生殖毒性，发育毒性和促癌性。低氧是一种常见的环境压力，能影响多种信号通路和细胞功能，是肿瘤发展的一个关键因素，但是藻毒素在不同氧浓度下的细胞毒性研究的并不多。藻毒素促癌的相关研究也相对较少，早期的研究主要以流行病学研究，慢性毒性实验和二阶段的致癌实验为主，但是这些实验耗时耗力，花费也相当大，所以近期的实验主要以分子生物学和细胞生物学实验为主要手段。NF-κB是一种遍在的多功能转录因子，其下游基因包括细胞因子，免疫受体，细胞凋亡调节基因（主要为抗凋亡基因），生长因子，细胞周期和转录因子，并且在癌症发生中起到重要作用。肿瘤的形成是一个非常复杂的过程，因此本实验选择NF-κB主要研究对象。本文通过细胞生物学和分子生物学等实验手段首先研究了不同氧浓度下微囊藻毒素的细胞毒性，其次研究在常氧下藻毒素促细胞增殖的机理，来探讨微囊藻毒素制毒机理和促癌性的分子机制。
　　主要结果和结论:
　　1.氧浓度显著地影响了MC-LR的细胞毒性。MC-LR在不同氧浓度下对HepG2细胞毒性截然不同，低氧条件下MC-LR诱导细胞凋亡，但是常氧下MC-LR促进HepG2细胞增殖。实验结果表明c-IAP2在MC-LR促癌活性中发挥了重要作用，氧化损伤是MC-LR-低氧诱导的细胞凋亡的关键因子。除此之外，实验结果证明无论是在低氧或常氧下，藻毒素不仅激活了死亡信号，同时也激活了生存信号，由此推测，细胞表现出较强的信号效应。
　　2.为了研究MC-RR促细胞增殖的分子机理，我们首先通过细胞增殖实验发现MC-RR能促HeLa细胞增殖。其次，我们通过细胞周期分析发现20和40μg/ml的MC-RR显著地促进了G1到S细胞周期进程。凝胶阻滞实验(EMSA)实验结果表明20和40μg/ml的MC-RR作用12h增强了HeLa细胞NF-κB的DNA结合活性，，60和80μg/ml的MC-RR则减弱了NF-κB的DNA结合活性。荧光定量PCR和WesternBlot实验结果表明NF-κB下游基因c-flip和c-myc的转录以及cyclinD1和c-IAP2转录和表达在20和40μg/ml的MC-RR作用12h和24h后均呈现不同程度的上调。实验结果证明MC-RR通过增强转录因子NF-κB的活性，激活其下游抗凋亡和细胞周期素等基因促细胞增殖，由此推测NF-κB在藻毒素促癌过程中起到了重要作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1．水体富营养化与蓝藻水华

2．藻毒素的产生

3．微囊藻毒素的结构和理化性质

4．藻毒素毒性研究

4．1 肝毒性

4．2 肾毒性

4．3 遗传毒性

4．4 其他毒性

5．藻毒素的致毒机理

6．藻毒素与氧化应激

7．藻毒素与癌症

8．本研究的目的和意义

第二章 材料和方法

1．主要试剂和试剂盒

2 细胞培养

3．试验方法

3．1 不同氧浓度下MC-LR的细胞毒性

3．2 MC-RR促细胞增殖机理的初探

4．统计分析

第三章 结果与分析

1．不同氧浓度下MC-LR的细胞毒性

1．1 细胞活性

1．2 线粒体膜电位(MMP)变化

1．3 SOD活性变化

1．4 Real-Time PCR结果

1．5 Western Blot结果

2．MC-RR促细胞增殖机理的初探

2．1 细胞活性

2．2 细胞周期分析

2．3 NF-κB活性—EMSA

2．4 Real-Time PCR结果

2．5 Western Blot结果

第四章 讨论

第五章 结语

参考文献

致谢

附录：在读期间学术论文发表情况