陆地棉纤维次生壁加厚期正向消减文库的构建及差异表达基因分析

摘要

棉花是重要的经济作物，也是纺织工业中天然纤维的主要来源。此外，棉纤维细胞也是研究植物细胞伸长、纤维素合成和次生壁发育的理想模式材料。近年来，伴随着各种高通量研究策略的使用，棉纤维发育的遗传机理得到了更深层次的研究，并取得了一系列重要的研究成果。然而，大部分研究主要集中在纤维发育的起始和伸长阶段，对次生壁加厚期的研究还相对较少，极大地限制了利用基因工程手段改良棉纤维比强度这一重要纤维品质性状的步伐。因此，有必要针对棉纤维次生壁加厚期的遗传机理开展进一步的研究，为棉花分子育种提供更多可利用的基因资源。
　　 本研究以陆地棉高断裂比强度材料0-153和转基因抗虫棉sGK9708为亲本构建的高代重组自交系群体(F6:9)中选育出的高比强度纤维品系(H，69307)作为研究材料，利用抑制性消减杂交(SSH)技术，构建了陆地棉纤维次生壁加厚期的正向消减cDNA文库，并对差异表达基因进行分析。本研究结果如下：
　　 1、本研究以H15DPA纤维为driver、H20DPA纤维为tester，成功构建出陆地棉纤维次生壁加厚期的正向消减cDNA文库。该文库共包含1152个阳性克隆，重组率为97.04%，滴度为1.89×104cfu/ml。
　　 2、对挑选的1152个阳性克隆进行反向Northern筛选，共得到340个差异表达克隆，代表115个非冗余基因，其中包含35个重叠群，80个单拷贝。生物信息学分析表明，这些差异表达基因广泛参与了糖类、脂类、氨基酸等物质的代谢，以及纤维素生物合成、细胞壁合成与修饰、氧化还原、细胞信号转导等生物学过程。
　　 3、从115个差异表达基因中选取18个代表性基因，利用荧光定量PCR进行表达模式分析。结果表明，所挑选的基因在H20DPA纤维中的表达水平均明显高于其在H15DPA纤维中的表达水平，说明消减文库的结果真实，可靠。同时，也暗示这些基因可能与棉纤维的次生壁加厚相关。上述18个基因包括水通道蛋白、阿拉伯半乳糖蛋白4、类受体蛋白激酶、类成束蛋白阿拉伯半乳糖蛋白1、类成束蛋白阿拉伯半乳糖蛋白16、类几丁质酶蛋白1、FbLate-2、纤维素合成酶1、纤维素合成酶2、果胶甲酯酶5、细胞色素C氧化还原酶，Cobra-like4蛋白、NADH脱氢酶亚基、植物类糖原淀粉起始蛋白3、分泌载体膜蛋白、功能未知基因1-A10、功能未知基因3-E3、功能未知基因10-F6。
　　 4、利用简单序列重复识别工具SSRIT对115条EST序列进行简单序列重复(SSR)位点的筛选，共得到16条含有SSR位点的序列，并设计了16对SSR引物。
　　 5、通过对16个EST-SSR分子标记的多态性检测发现，其中1个标记具有共显性。此外，经遗传连锁作图及染色体定位分析将该标记定位在陆地棉第16号染色体上，且与CGR5621S标记紧密连锁，遗传距离仅0.6cM。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略表

1 前言

1.1 棉纤维发育的进程

1.1.1 起始期

1.1.2 伸长期

1.1.3 次生壁加厚期

1.1.4 成熟期

1.2 棉纤维次生壁加厚期的研究进展

1.2.1 次生壁加厚期的主要酶系

1.2.2 棉纤维次生壁加厚期相关基因的克隆及表达分析

1.3 差异表达基因的研究策略

1.3.1 mRNA差异显示技术

1.3.2 基因表达序列分析技术

1.3.3 基因芯片技术

1.3.4 Solexa测序技术

1.4 抑制性消减杂交技术

1.4.1 抑制性消减杂交技术的原理

1.4.2 抑制性消减杂交技术的流程

1.4.3 抑制性消减杂交技术在棉花差异表达基因研究中的应用

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 植物材料

2.1.1 高比强度品系69307的选育

2.1.2 材料种植

2.1.3 取材

2.2 棉纤维总RNA提取及质量检测

2.2.1 准备工作

2.2.2 总RNA提取

2.2.3 总RNA质量检测

2.3 SMATer cDNA合成

2.3.1 cDNA第一链合成

2.3.2 LD PCR扩增cDNA

2.3.3 双链cDNA柱层析纯化

2.4 抑制性消减杂交

2.4.1 RsaI酶切

2.4.2 酶切产物纯化

2.4.3 接头连接

2.4.4 接头连接效率检测

2.4.5 第一轮杂交

2.4.6 第二轮杂交

2.4.7 第一轮PCR扩增

2.4.8 第二轮(巢氏)PCR扩增

2.4.9 消减效率检测

2.5 H20正向消减文库的构建及初步筛选

2.5.1 二次PCR产物纯化

2.5.2 文库构建

2.5.3 菌落PCR检测

2.6 反向Northern筛选差异表达克隆

2.6.1 杂交探针制备

2.6.2 cDNA微阵列膜的制备

2.6.3 杂交检测

2.7 差异表达克隆测序及生物信息学分析

2.7.1 差异表达克隆测序

2.7.2 生物信息学分析

2.8 荧光定量PCR

2.8.1 cDNA第一链的合成

2.8.2 引物设计

2.8.3 荧光定量PCR反应体系和程序

2.9 EST-SSR分子标记

2.9.1 EST-SSR分子标记的开发

2.9.2 棉花基因组DNA的提取

2.9.3 SSR标记多态性检测

2.9.4 连锁图谱的构建

3 结果与分析

3.1 总RNA提取

3.2 双链cDNA合成质量检测

3.3 Rsa Ⅰ酶切效率检测

3.4 接头连接效率检测

3.5 巢氏PCR产物分析

3.6 消减效率分析

3.7 消减文库构建

3.8 菌落PCR检测插入片段大小

3.9 反向Northern筛选差异表达克隆

3.10 差异表达克隆的测序及生物信息学分析

3.10.1 差异表达克隆的测序

3.10.2 差异表达序列的同源比对分析

3.10.3 差异表达序列的GO功能分类及KEGG代谢途径分析

3.11 qRT-PCR分析差异表达基因的时空表达特征

3.12 EST-SSR标记开发、检测及染色体定位

3.12.1 EST-SSR标记开发

3.12.2 EST-SSR标记多态性检测及染色体定位

4 讨论

4.1 高质量棉纤维总RNA的提取

4.2 SSH技术构建消减文库

4.3 棉纤维次生壁加厚期与伸长期相比较的代谢变化

4.4 纤维次生壁加厚期的差异表达基因

4.4.1 水通道蛋白

4.4.2 类成束蛋白阿拉伯半乳糖蛋白

4.4.3 类受体蛋白激酶

4.4.4 果胶甲酯酶

4.4.5 其他差异表达基因

4.5 EST-SSR分子标记的开发与应用

5 参考文献

致谢

附录1

附录2

作者简介

论文发表情况