ATPase域调节结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA的相互作用

摘要

DNA螺旋酶是一种类型Ⅱ的拓扑异构酶，它是唯一的能够能够向DNA链中引入负超螺旋的拓扑异构酶，这一过程是需要ATP水解的能量。螺旋酶存在于细菌体内，但是人体内不含有此种酶，所以成了很多药物的靶标，比如临床上应用比较广泛的喹诺酮药物。
　　 但是关于GyrA和GyrB之间的具体的作用区域或者是位点还没有人进行研究，本人所在的课题组借助前人的关于螺旋酶的作用的模型已经把相互作用的范围缩小在GyrB的Toprim结构域。我们本课题就是基于这个基础提出的，我们通过对GyrB的ATPase域进行逐步的截短，然后通过酵母双杂交技术进行验证阶截短的GyrB能够和GyrA发生相互作用，并利用X-gal显色的方法证明两者之间的结合能力的大小，并进行两者之间的亲和力和结合常数的大小，并通过一定的手段来测定截短的GyrB以及重组酶相对于野生型的构象的变化。
　　 本课题的目的是想得出GyrB的ATPase结构域在GyrA和GyrB之间的相互作用中起的作用以及这个结构域是通过何种方式来影响两者之间的相互作用的。能够为治疗结核病的药物的开发提供一定的理论基础。
　　 本课题的主要研究结果为：
　　 1、依据gyrB基因序列，扩增突变体片段gyrB79-714、gyrB183-714、gyrB△79-182、gyrB△294-465；将扩增的片段分别与表达载体pET28a和酵母载体pGADT7相构建；并进行蛋白纯化。
　　 2、酵母双杂交、SPR等实验结果证明：ATPase、Transducer是调节GyrA和GyrB相互作用的重要区域。
　　 3、圆二色谱实验结果显示，当ATPase和Transducer区域被缺失掉以后，与野生型GyrB相比较，突变体的二级结构发生了很大改变。证明这两个区域对于维持GyrB的结构稳定起着很重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩语表

1 前言

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 培养基

3.1.2 本实验所涉及质粒

3.1.3 菌株

3.1.4 酶、常用试剂盒及常用试剂

3.1.5 溶液及缓冲液

3.1.6 仪器

3.2 方法

3.2.1 结核分枝杆菌螺旋酶B亚基及其系列缺失突变体的构建

3.2.2 结核分枝杆菌螺旋酶B亚基缺失突变体的表达与纯化

3.2.3 酵母双杂交检测GyrA、GyrB的突变体系列之间相互作用

3.2.4 SPR方法检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间的相互作用

3.2.5 圆二色谱法来比较野生型GyrB和GyrB系列突变体之间的二级结构差异

4 结果与分析

4.1 各缺失突变体的构建及蛋白质的表达纯化

4.1.1 GyrB突变体的pET28a和pGADT7载体的构建

4.1.2 GyrB突变体蛋白质表达与纯化

4.2 酵母双杂交方法验证GyrA亚基与GyrB及其缺失突变体的相互作用

4.3 圆二色谱技术分析GyrB缺失突变体之间二级结构的差异的

4.4 表面等离子共振方法分析A亚基与缺失突变体之间的相互作用

4.4.1 SPR检测GyrB动力学常数

4.4.2 GyrB各缺失突变体结合活力大小比较

5 讨论

5.1 ATPase域对GyrA和GyrB相互作用的影响

5.2 缺失ATPase会对螺旋酶功能产生的影响

6 结论

参考文献

致谢