纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因CsGID1的功能分析

摘要

近年来，赤霉素受体基因GID成为研究的热点，在许多植物中如拟南芥、水稻、杨树、棉花，葡萄等有所研究，但在柑橘上的研究未见报道。为了研究赤霉素受体基因GID在柑橘上的作用，本论文以纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因Cs GID1为研究对象，采用转基因技术获得转CsGID1基因烟草植株，并利用石蜡切片技术、亚细胞定位技术、CIRAS-2光合仪，实时荧光定量PCR技术从植物细胞组织、光合生理特性、目的基因的表达量等方面对转基因植株和对照植株进行了分析。主要研究结果如下：
　　 1.CsGID1基因序列经Blastn分析，发现它与葡萄(AFG17072.1)和拟南芥(XP_002874383.1)的GID1核酸序列相似性分别为81%和79%。用Blastx分析，纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因GID1与陆地棉的GID1同源性最高。
　　 2.本实验以转基因烟草叶片主脉为材料，通过石蜡切片实验，观察比较转基因植株和对照植株，结果显示，转基因CsGID1烟草叶片主脉木质部导管较对照植株多，且排列紧密不整齐。通过将pBI121-CsGID1-GFP转入洋葱表皮细胞中发现，CsGID1与GFP的融合蛋白在细胞核中表达。
　　 3.分别用GA3和多效唑处理转基因阳性植株，结果表明GA3处理的转基因植株最高，净光合速率最大，然而叶绿素含量(1.55±0.09 mg/g)最少；多效唑处理的转基因植株株高最矮，叶绿素含量(1.71±0.15mg/g)及净光合速率较大。
　　 4.利用实时荧光定量PCR对CsGID1基因在烟草的表达进行了分析，结果显示，CsGID1在转基因阳性植株中的表达量最高，其次是GA3处理的转基因植株，然而在多效唑处理的转基因植株中的表达量最低。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 前言

1.1 课题提出

1.2 赤霉素的研究进展

1.2.1 赤霉素的生物合成途径

1.2.2 赤霉素生物合成关键酶

1.2.3 赤霉素的信号传导途径研究

1.2.4 GA信号传导模式

1.2.5 赤霉素受体

1.2.6 DELLA蛋白

1.2.7 霉素受体基因GID1与DELLA蛋白的互作

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种与质粒

2.1.3 引物

2.2 主要试剂

2.2.1 各种酶类

2.2.3 抗生素

2.2.4 质粒提取试剂

2.2.5 DNA提取试剂

2.2.6 RNA提取试剂

2.2.7 反转录试剂

2.2.8 培养基

2.3 主要分析仪器设备

2.4 实验方法

2.4.1 烟草农杆菌的转化，培养

2.4.2 转基因烟草DNA提取

2.4.3 转基因植株的PCR鉴定

2.5 目的基因CsGID1的转化

2.5.1 目的基因CsGID1质粒提取

2.5.2 胶回收

2.5.3 大肠杆菌转化

2.5.4 农杆菌转化

2.6 CsGID1基因的亚细胞定位

2.6.1 CsGID1与GFP融合蛋白表达载体的构建

2.6.2 农杆菌介导的洋葱表皮细胞的转化和观察

2.7 定量PCR分析赤霉素受体基因CsGID1的表达

2.7.1 RNA提取

2.7.2 RNA纯化

2.7.3 cDNA的合成及引物特异性检测

2.7.4 定量PCR

2.8 转基因植株与对照植株叶片主脉导管观察

2.9 植株生理指标的测定

2.9.1 植株各项生理指标的测定

2.9.2 激素处理

2.9.3 转基因植株叶绿素含量的测定

2.9.4 净光合速率测定

3 结果与分析

3.1 CsGID1序列分析

3.2 CsGID1基因的亚细胞定位分析

3.3 转基因植株的分子鉴定

3.3.1 载体pMV-CsGID1的转基因植株nptⅡ的PCR检测

3.3.2 载体pMV-CsGID1的转基因植株中CsGID1基因的PCR检测

3.4 转基因植株木质素导管观察

3.5.1 植株株高，叶长，节间直径的测量

3.5.2 不同激素处理下植株的生长状况

3.5.3 转基因植株的光合特性分析

3.6 CsGID1基因的表达分析

4 讨论

4.1 CsGID1对植株形态影响的分析

4.2 CsGID1的表达分析

参考文献

附录

致谢