蓝细菌光敏色素AphC和RGS中GAF结构域的研究

摘要

蓝细菌光敏色素是发现于蓝细菌内的一种藻胆色素蛋白，其氨基酸序列与植物光敏色素有较高的同源性，生理功能上与植物光敏色素也有很大的相似性，在蓝细菌内起着光信号受体的作用。
　　 首先采用聚合酶链式反应方法从鱼腥藻PCC7120总DNA中克隆出蓝细菌光敏色素AphC中GAF1和GAF2结构域的基因片段，将这些基因片段构建入表达载体pET-30 a(+)中。含目的基因的表达质粒与含血红素氧化酶ho1基因和胆绿素还原酶基因pcyA的表达质粒同时转入大肠杆菌体内共表达。实验证明PCB-GAF1在700 nm和570 nm光照条件下分别表现为15 Z态和15 E态。色素蛋白经酸性尿素变性后，吸收峰值在662 nm左右，表明所连接的色素为藻蓝色素PCB。色素蛋白的蛋白质电泳经醋酸锌染色后，在紫外光照射下发出锌荧光，证明色素与蛋白的连接方式为共价偶联。利用光谱数据可计算得到色素蛋白的荧光量子产率和摩尔消光系数。光谱分析和锌电泳结果表明，GAF2不能结合PCB。色素蛋白PCB-GAF1可以用作遗传编码的荧光探针，其蛋白比GFP还小，故在生物医学标记中有重要的应用价值。
　　 本实验室采用融合基因的方法构建了一个来自集胞藻PCC6803的蓝细菌光敏色素RGS中GAF3结构域的色素荧光蛋白GAF3：Ho1：PcyA，通过大肠杆菌表达后可以发射强烈的荧光。本文在此基础上，利用这个荧光蛋白标记一种与大肠杆菌细胞分裂有关的蛋白MinD。通过分子克隆技术，MinD融合在该荧光蛋白的N端。通过大肠杆菌表达，细胞在670 nm处有荧光特征峰，在荧光显微镜下观察发现荧光主要出现在细胞的两端，这表明MinD主要分布于大肠杆菌的两端，与文献报导一致。实验证明色素荧光蛋白GAF3：Ho1：PcyA将是一个十分有价值的荧光探针。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

1 序言

1.1 蓝细菌

1.2 光合作用

1.3 捕光天线

1.3.1 蓝细菌中的捕光结构

1.4 藻胆体

1.4.1 藻胆色素的生物合成

1.4.2 铁氧还蛋白依赖的胆色素还原酶

1.5 光敏色素的发现

1.5.1 光敏色素的结构和光化学性质

1.6 蓝细菌光敏色素的发现

1.6.1 蓝细菌光敏色素的特征

1.7 本课题的研究意义和展望

2 AphC中GAF结构域的研究

2.1 序言

2.2 材料与试剂

2.2.1 主要材料

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要仪器

2.3 主要实验方法

2.3.1 藻总DNA的提取

2.3.2 PCR扩增基因片断

2.3.3 从琼脂糖凝胶中回收DNA

2.3.4 碱裂解法抽提质粒

2.3.5 克隆载体pBlu-gaf 1 和pBlu-gaf 2 的构建

2.3.6 感受态细胞的制备与质粒的转化(CaCl2法)

2.3.7 阳性克隆的挑取

2.3.8 表达质粒pET-30 a(+)-gaf 1和pET-30 a(+)-gaf 2的构建

2.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.3.10 多质粒转化与共表达

2.3.11 重组产物的超声破碎与提纯

2.3.12 蛋白质锌电泳

2.3.13 荧光量子产率的计算

2.3.14 色素蛋白的变性和摩尔消光系数的计算

2.3 结果与分析

2.3.1 AphC的GAF 1和GAF 2同源性分析

2.3.2 gaf 1 和gaf 2 的PCR结果

2.3.3 pBlu-gaf 1 和pBlu-gaf 2 构建的电泳图谱

2.3.4 pET-30 a(+)-gaf 1 和pET-30 a(+)-gaf 2 构建的电泳图谱

2.3.5 pET-30 a(+)-gaf 1 和pET-30 a(+)gaf 2 的蛋白质电泳检测结果

2.3.6 pET-30 a(+)-gaf 1 和pET-30 a(+)-gaf 2 的测序结果

2.3.7 重组产物光谱分析

2.3.8 色素蛋白PCB-GAF 1的变性实验

2.3.9 色素蛋白SDS-PAGE电泳和锌电泳

2.4 讨论

3 色素蛋白荧光探针

3.1 序言

3.2 村料与方法

3.2.1 主要材料

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器

3.3.主要实验方法

3.3.1 荧光显微镜的使用方法

3.3.2 细菌基因组DNA提取

3.4 结果与分析

3.4.1 minD和gaf3：ho1：pcyA的PCR结果

3.4.2 pBlue-minD构建的电泳图谱

3.4.3 pBlue-minD测序结果

3.4.4 pETDuet-minD构建的电泳图谱

3.4.5 pETDuet-minD的蛋白质电泳检测结果

3.4.6 pETDuet-minD：g3：ho1：pcyA构建的电泳图谱

3.4.7 pETDuet-minD：g3：ho1：pcyA的表达

3.3.8 pETDuet-minD：g3：ho1：pcyA的荧光显微镜图片

3.4 本章讨论

参考文献

附录

致谢