水稻OsEMF2b突变体的细胞学研究及PcG类基因的组织原位杂交分析

摘要

水稻（Oryza sativa）是全世界最重要的粮食作物之一，也是研究单子叶植物遗传和发育的模式植物。拟南芥的多梳蛋白（Polycomb group protein,PcG）复合物PRC2以表观遗传机制抑制靶基因的转录，调控多个生长发育过程。水稻的OsEMF2b和OsFIE基因编码PcG蛋白，其突变或干涉下调后导致开花时间改变、花器官异常、结实率降低等表型。本研究采用细胞组织化学以及胚胎学研究方法，观察水稻OsEMF2b T-DNA插入突变体生殖发育的细胞学过程，采用细胞组织原位杂交（In Situ Hybridization）技术，分析水稻PcG类基因OsEMF2b、OsFIE1、OsFIE2的时空表达，为确定水稻PcG类基因的功能提供表达数据和细胞学依据。
　　主要研究结果如下：
　　1.OsEMF2b基因调控水稻颖花的发育
　　通过对水稻OsEMF2b杂合突变体和Osemf2b纯合突变体颖花进行石蜡切片观察，发现突变体颖花的雄蕊和雌蕊的数量发生了改变，表明OsEMF2b基因控制水稻颖花的发育。
　　2.OsEMF2b基因不影响水稻雌雄配子体的发育。
　　以野生型水稻为对照，对OsEMF2b杂合突变体植株的花药、花粉和胚珠、胚囊的发育过程进行了详细的细胞学观察。结果表明，OsEMF2b杂合突变株花药的结构和花粉的发育在各个时期表现正常，在胚珠和胚囊发育过程中也没有观察到明显的形态和结构异常。对Osemf2b纯合突变体花药的切片观察，未发现败育的细胞学现象。花粉成熟期碘染结果显示其育性正常。这些结果表明OsEMF2b基因不影响水稻雌、雄配子体的发育。
　　3.OsEMF2b基因调控水稻种子的发育
　　对OsEMF2b杂合突变体种子发育的细胞学研究结果显示，突变体种子发育过程中出现一定比例的胚和胚乳不发育、胚胎发育延迟、胚胎畸形，胚乳游离核不细胞化和胚乳细胞退化解体等异常现象。表明OsEMF2b基因控制水稻胚和胚乳的发育。
　　4.OsEMF2b基因在水稻不同组织器官中的表达
　　以水稻OsEMF2b基因的mRNA为探针，检测水稻根、茎、叶和不同发育阶段的花药、不同发育阶段的胚和胚乳等器官和组织中的时空表达。结果表明，OsEMF2b基因在水稻营养器官根、侧根、茎、叶和叶鞘中均有表达，在小花原基、发育早期的花药中有较显著的杂交信号，但在发育后期的花药和花粉中的表达减弱。OsEMF2b基因在受精后不同发育时期的种子中均有表达，但在发育早、中期的胚胎、胚乳组织中的表达信号略强于发育后期。原位杂交结果显示OsEMF2b基因在水稻各组织中呈组成型表达，与其定量RT-PCR检测结果一致；其在花原基、种子发育过程的组织器官表达特点与其突变表型相符合，表明该基因可能在水稻花器官和种子发育过程中有重要作用。
　　5.OsFIE1和OsFIE2基因在水稻不同组织器官中的表达
　　根据OsFIE1基因在水稻不同组织器官的定量RT-PCR检测结果，该基因在水稻种子中特异表达。本实验原位杂交结果显示OsFIE1基因在叶、茎、花药中有十分微弱的信号，其明显的杂交信号主要在受精后3-7天的种子中，而且在3天、5天的胚乳组织、种皮细胞中的表达最强，高于胚胎组织。表明OsFIE1基因可能参与调控水稻特定时期胚乳和种皮的发育。
　　OsFIE2基因的表达模式与OsFIE1明显不同，在检测的所有组织和器官中都有OsFIE2的杂交信号，呈组成型表达。但其在根、茎中的表达强于在叶片中的表达，在小花原基和花药中也有明显杂交信号，在受精后1-3天的种子中的表达强于5、7天的种子，在胚和胚乳组织中的表达未见明显差异。表明OFIE2基因可能参与水稻多个生长发育过程调控。

目录

声明

1. 前言

1.1 多梳蛋白（PcG）类基因研究概述

1.2 拟南芥中EMF基因的功能

1.3 水稻中EMF基因研究进展

1.4 FIE基因研究概述

1.5 本研究的目的和意义

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1水稻OsEMF2b杂合突变体的细胞学观察

2.2.2水稻Osemf2b纯合突变体的细胞学观察

2.2.3组织原位杂交方法

3. 结果与分析

3.1 水稻OsEMF2b基因控制颖花发育

3.2 水稻OsEMF2b突变体花药和胚囊发育正常

3.3 水稻OsEMF2b杂合突变体胚和胚乳发育异常

3.4 水稻OsEMF2b基因在不同器官和组织中的表达

3.5 水稻OsFIE1和OsFIE2基因在不同器官和组织中的表达

4. 讨论

4.1 水稻OsEMF2b基因与花器官发育

4.2 水稻OsEMF2b基因与种子发育

4.3 水稻OsEMF2b基因在其生长发育过程中的作用分析

4.4 水稻OsFIE基因在其生长发育过程中的作用分析

参考文献

附录

一、石蜡切片制作流程

二、原位杂交实验步骤

三、原位杂交所用试剂配方

致谢