牛传染性鼻气管炎病毒基因缺失疫苗的研究

摘要

牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒或牛疱疹病毒1型（infectious bovine rhinotracheitis virus or Bovine herpesvirus-1，BoHV-1）引起的牛的病毒性传染病。该病能够引起上呼吸道及气管发炎，呼吸困难、流鼻涕，此外还有结膜炎、龟头炎、阴道炎，新生牛的全身性感染。现有防治方法主要是使用传统疫苗，包括传统灭活疫苗和减毒活疫苗，但是他们自身都存在各自的缺点，比如灭活疫苗的制备过程会破坏抗原性，减毒活疫苗存在毒力返强的风险并且还有免疫抑制。为了克服这些缺点，我们将毒力基因和免疫抑制基因gG，TK和gE先后进行了缺失，本研究利用同源重组原理，通过报告基因EGFP便于筛选，先后将gG和TK基因缺失，构建了BoHV-1gG–/TK–双基因缺失病毒，对其生物学特性、安全性、免疫性和保护力进行了研究；为了进一步使该病毒致弱，本研究还继续将gE基因缺失，最终获得BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+基因缺失病毒，并对其免疫保护力进行了研究；此外，本文还进行了BoHV-1gG–/TK–和BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+抵抗BoHV-5的研究。主要研究内容如下：
　　1.BoHV-1gG–/TK–的生物学特征研究BoHV-1gG–/TK–形成的空斑直径比野生型病毒减少72％，生长滴度下降约10倍。体外遗传稳定性研究证明了连续传30代，该重组病毒依然稳定。以不同的比例和野生型病毒混合，最终都没有检测到其他重组病毒。体内连续传五代也没有发现该基因缺失病毒有毒力返强的现象，从传到第三代后，病毒和其核酸没有被检测到。
　　2.BoHV-1gG–/TK–的兔体研究通过鼻腔接种，从临床上可以观察到接种BoHV-1gG–/TK–的兔子表现出轻微的症状，但是wt BoHV-1组则表现出更严重的症状。BoHV-1gG–/TK–能够诱导细胞免疫，以Th1类细胞因子为主，但是细胞因子主要是wt BoHV-1诱导产生的量更多。BoHV-1gG–/TK–诱导产生的中和抗体滴度下降。接种BoHV-1gG–/TK–的兔子鼻腔排毒量和排毒时间明显少于wt BoHV-1组。以上数据表明该重组病毒在兔体上是致弱的。免疫21天后肌肉注射地塞米松，BoHV-1gG–/TK–没有被激活，而wt BoHV-1被再次激活。在野毒组和BoHV-1gG–/TK–组中兔子的三叉神经节中都检测到了病毒核酸，说明BoHV-1gG–/TK–可以建立潜伏感染，但是不能被地塞米松激活。
　　3.BoHV-1gG–/TK–的牛体研究通过鼻腔接种三种病毒（BoHV-1 gG–/TK–、BoHV-1TK–/gE–/EGFP+基因缺失重组病毒和野毒）进行平行实验，用三个剂量4×105PFU,4×106PFU和4×107PFU，评价了BoHV-1gG–/TK–安全性、免疫性和保护力。鼻腔接种后，BoHV-1gG–/TK–和BoHV-1TK–/gE–/EGFP+组中的任何剂量组的动物都没有出现临床症状，但是野毒对照组却出现了典型的牛传染性鼻气管炎的症状。BoHV-1gG–/TK–能够在体内外诱导更高水平的IFN-β。但是其他细胞因子例如：IFN-γ和TNF-α的产生量很低。连续肌肉注射地塞米松不能使BoHV-1gG–/TK–再激活，这与兔体的实验结果一致。攻毒后，BoHV-1gG–/TK–组的中、高剂量都能提供完全的保护力。所有数据都表明BoHV-1gG–/TK–毒力是充分致弱的，能够提供免疫保护力，并且比商品化疫苗株BoHV-1TK–/gE–/EGFP+，因此可望成为抗IBR的标记疫苗后选毒株。
　　4.BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+的生物学特征研究以BoHV-1gG–/TK–为亲本株，进一步缺失gE基因，获得BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+重组病毒。三基因缺失病毒的空斑直径比野生型病毒wtBoHV-1减小78%，比亲本株BoHV-1gG–/TK–减小约6%。生长曲线和亲本株相似。病毒的滴度没有明显发生变化。
　　5.BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+免疫抵抗wt BoHV-1的牛体研究将三种重组病毒BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+、BoHV-1gG–/TK–和BoHV-1gG–/TK–/gE–以4×107PFU/头分别鼻腔接种牛体，比较观察三种重组病毒对牛体的安全性、免疫性和抗wt BoHV-1感染能力。接种后虽然基因缺失病毒组的个别牛都有少量的鼻腔分泌物，但是没有影响牛的采食和饮水及精神状态，也没有出现其他临床症状。免疫后的排毒量和排毒时间都是少于野毒对照组。在所有基因缺失免疫组中 BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+组的排毒量最少。虽然 BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+诱导产生的细胞因子以及中和抗体都偏低，但是sIgA的量在免疫后第14天和28天高于其他组。注射地塞米松后，BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+不能被激活。检测各个组的BoHV-1的总抗体滴度发现，注射地塞米松与没有注射地塞米松相比，野毒对照组的抗体滴度出现了骤增，而其他组的抗体滴度没有发生明显的变化。攻毒后，BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+能够提供免疫保护力，该免疫组的动物临床症状明显低于未免疫组，排毒量和排毒时间都低于未免疫组。所有基因缺失病毒免疫组的肺脏组织评分都低于未免疫组，但是BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+免疫组的分值高于其他两组基因缺失免疫组（P=0.45）。双基因病毒保护效果优于三基因缺失病毒，但三基因缺失病毒毒力进一步降低，所以该重组病毒也可成为疫苗选株。
　　6.BoHV-1gG–/TK–和BoHV-1gG–/TK–/gE–/EGFP+抵抗wt BoHV-5感染的牛体研究鼻腔分别接种4×107PFU/头剂量的BoHV-1gG–/TK–和gG–/TK–/gE–/EGFP+，免疫28天后，用wt BoHV-5鼻腔攻毒，攻毒剂量为4×107PFU/头。免疫组表现出的神经症状轻于未免疫组，排毒量和时间都少于未免疫组。虽然未免疫组的牛没有出现致死性的神经症状，但是表现出来的症状也重于两个免疫组。中枢神经组织切片观察证明，免疫组的脑组织和三叉神经节的病变都明显轻于未免疫组，与临床表现出来的症状一致，双基缺失病毒保护效果优于三基因缺失病毒。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

第1章 文献综述

1.1 牛传染性鼻气管炎

1.2 IBR的危害及流行病学

1.3牛疱疹病毒1型的特性

1.3.1 病毒的分类及理化性质

1.3.2 BoHV-1编码的蛋白及功能

1.3.3 BoHV-1体外生长特性及在细胞内的复制

1.3.4 致病机制

1.4 牛感染BoHV-1后的免疫反应

1.4.1细胞免疫

1.4.2 体液免疫

1.5 潜伏感染与再激活

1.5.1 神经嗜性

1.5.2 潜伏感染与再激活

1.6 BoHV-1的免疫抑制与逃避机制

1.7 IBR的防治

1.7.1 BoHV-1疫苗研制的困难和目标

1.7.2 现有的疫苗种类及免疫性

1.7.3 DIVA的策略

第2章 BoHV-1 gG–/TK–的研究

2.1 目的意义

2.2 材料与方法

2.2.1 试验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果和分析

2.3.1 BoHV-1gG–/EGFP+的构建

2.3.2 BoHV-1gG–/EGFP+的PCR鉴定

2.3.3 BoHV-1gG–/EGFP+的Western bloting

2.3.4 BoHV-1gG–重组质粒pcDNA3.1-ZYP-1的构建与鉴定

2.3.5 BoHV-1gG–的构建

2.3.6 BoHV-1gG–的PCR鉴定

2.3.7 BoHV-1gG–/TK–/EGFP+基因缺失病毒的构建

2.3.8 BoHV-1gG–/TK–/EGFP+的鉴定

2.3.9 BoHV-1gG–重组质粒pcDNA3.1-ZYP-1的构建与鉴定

2.3.10 BoHV-1 gG–/TK–基因缺失病毒的构建

2.3.11 BoHV-1 gG–/TK–基因缺失病毒的PCR鉴定

2.3.12 BoHV-1gG–/TK–基因缺失病毒的Western bloting

2.3.13 BoHV-1gG–/TK–基因缺失病毒 Hind III 酶切

2.3.14 BoHV-1 gG–/TK–生物学特性

2.3.15 BoHV-1 gG–/TK– 兔体研究

2.3.16 BoHV-1 gG–/TK–牛体研究

2.4 讨论

2.4.1 BoHV-1 gG–/TK–双基因缺失突变株的构建

2.4.2 BoHV-1 gG–/TK–生物学特征研究

2.4.3 BoHV-1 gG–/TK–兔体研究

2.4.4 BoHV-1 gG–/TK–的本动物研究

第3章BoHV-1 gG–/TK–/gE–/EGFP+三基因缺失病毒的研究

3.1 目的意义

3.2 材料与方法

3.2.1 试验材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1缺失gE 转移载体的构建

3.3.2 重组质粒预转染

3.3.3 gG–/TK–/gE–/EGFP+的构建

3.3.4 gG–/TK–/gE–/EGFP+的鉴定

3.3.5 gG–/TK–/gE–/EGFP+的生物学特性

3.3.6 gG–/TK–/gE–/EGFP+抵抗BoHV-1的本动物研究

3.3.7 gG–/TK–/gE–/EGFP+与gG–/TK–抵抗wt BoHV-5的研究

3.4讨论

3.4.1 生物学特性

3.4.2 本动物研究

3.4.3 BoHV-1 gG–/TK–和gG–/TK–/gE–/EGFP+抵抗wt BoHV-5的研究

第4章 结论

参考文献

致谢

附录