茄属种及其种间体细胞杂种的染色体特征分析

摘要

通过细胞融合的方式将马铃薯野生种或其他茄属近缘种的优良性状引入马铃薯栽培种是马铃薯资源创制的重要途径之一。研究体细胞杂种基因组中来自双亲的染色体的组成和重排，并在染色体水平解析性状的改变与染色体导入的联系，对基于染色体水平的马铃薯育种和细胞遗传学研究具有重要意义。荧光原位杂交是联系DNA序列和染色体生物学研究的重要工具。因此，本研究建立并优化了马铃薯荧光原位杂交体系，在此基础上对可能用于马铃薯资源创制的茄属几个相关种的染色体特征进行了研究，同时对马铃薯S.tuberosum和S.melongena的几个体细胞杂种进行了染色体分析。主要研究结果如下:
　　 1.基于BAC-FISH标记的马铃薯染色体核型本研究
　　 首先采用5个来自S.tuberosum和7个来自S.bulbocastanum的染色体特异BAC，通过BAC-FISH识别了马铃薯野生种S.chacoense的全套12条染色体。然后据已报道的遗传图谱、BAC连锁群以及前人核型分析信息，按照染色体和对应的BAC-FISH杂交结果将染色体进行排列，建立了S.chacoense12条染色体标准图，为后续研究奠定了基础。
　　 2.马铃薯、番茄、茄子染色体的ITR分布特征
　　 以二倍体茄属代表种S.tuberosum(A genome)、S.chacoense(Agenome)、S.bulbocastanum(B genome)、S.pinnatisectum(B genome)、S.paucissectum(P genome)、S.lycopersicum和S.melongena为材料，开展了端粒探针FISH杂交。结果显示，内部端粒序列(ITR)在供试种染色体着丝粒区域大量扩增。Dot blot定量分析发现，各个种中端粒序列相对含量的增加与FISH检测到的端粒信号强弱基本一致。大量来源于ITR的FISH信号被定位于S.pinnatisectum(B genome)粗线期染色体的主缢痕中。另外，在马铃薯A genome种S.chacoense第12染色体长臂的亚着丝粒区域检测到一对杂合的ITR位点。这些结果暗示，ITR可能与功能着丝粒有关。
　　 3.茄属代表种rDNA分布
　　 通过PCR扩增分别得到S.tuberosum、S.chacoense和S.melongena的5S rRNA基因和45S rRNA基因间隔区(IGS)的5'ETS。序列分析显示，S.tuberosum和S.chacoense的5S rRNA基因间隔区高度同源，5'ETS序列也高度同源。而S.tuberosum和S.melongena的5S rRNA基因间隔区序列差异较大，5'ETS序列差异也较大。用S.tuberosum5S rDNA和25S rDNA作为FISH探针，与7个马铃薯种和1个番茄、1个茄子种染色体进行原位杂交，结果显示，在所杂交的材料中，5S rDNA只在1组同源染色体上有杂交信号，25S rDNA除了S.melongena在3对非同源染色体上均有信号外，其它种也只在1组同源染色体上有信号。配对分析显示，5S rDNA和25SrDNA位于不同的染色体。信号分析还表明，在S.tuberosum、S.berthauhii、S.bulbocastanum、S.acaule和S.melongena5个种中，同源染色体之间的5S rDNA或25S rDNA信号强弱存在明显差异。
　　 4.寡核苷酸SSR在茄属几个种染色体上的分布
　　 通过FISH分别研究了单、二和三核苷酸SSR，包括(A)n、(C)n、(CG)n、(AC)n、(TC)n、(AT)n、(AAC)n、(AAG)n、(AAT)n、(AGG)n、(CAC)n、(CAT)n、(CAG)n、(ACT)n、(ACG)n和(GCC)n在马铃薯栽培种S.tuberosum和野生种S.chacoense中期染色体上的物理分布。总体上，所有核苷酸SSR在染色体上呈散点状分布。(A)n在S.chacoense中信号主要位于染色体末端和部分着丝粒区域，而在S.tuberosum中信号较少且分布没有明显规律。(AAT)n、(ACT)n和(CAG)n在S.chacoense中几乎出现在所有染色体的末端，但在其他部位很少发现，而在S.tuberosum中除去少数染色体末端外其他多数信号呈点状分散分布于整个染色体上。进一步分别采用混合的单、二和三核苷酸SSR在马铃薯种S.chacoense、S.bulbocastanum和S.pinnatisectum以及番茄有丝分裂中期染色体上开展了FISH定位。结果显示，单和二核苷酸SSR在马铃薯种和番茄染色体上的分布模式类似。三核苷酸SSR在马铃薯种间的分布模式类似，但在马铃薯和番茄间表现出很大的差异，在番茄中几乎所有的信号都集中于染色体着丝粒附近并且信号强烈，而在马铃薯中信号主要位于大多数染色体末端并呈点状分布。在一定程度上，该研究对马铃薯种间以及马铃薯和番茄之间差异SSR的筛选提供了依据。
　　 5.S.tuberosum与几个相关种染色体GISH分析以马铃薯栽培种S.tuberosum基因组DNA为探针，与包括S.tuberosum(Agenome)、S.chacoense(A genome)、S.pinnatisectum(B genome)、S.bulbocastanum(B genome)、S.paucissectum(P genome)、S.etuberosum(E genome)、S.lycopersicum(L genome)和S.melongena在内的茄属种进行GISH杂交，结果显示，S.tuberosum与S.chacoense、S.paucissectum的基因组DNA同源性最高，其次是S.etuberosum和S.pinnatisectum，再次是S.bulbocastanum。S.lycopersicum和S.melongena与S.tuberosum同源性最低。因此，如果GISH用于体细胞杂种染色体组分分析，能够有效鉴定S.tuberosum与S.bulbocastanum(B genome)、S.lycopersicum和S.melongena的体细胞杂种，但S.tuberosum与S.chacoense(A genome)和S.paucissectum(Pgenome)的体细胞杂种很难用GISH分析鉴定染色体组分。
　　 6.体细胞杂种染色体组成鉴定
　　 研究以S.chacoense基因组DNA为探针，分别采用不封阻、封阻两种方式对S.tuberosum和S.chacoense的体细胞杂种进行GISH分析，结果显示，由于双亲同源性较高，不能清楚地分析杂种的染色体组分。进一步分别采用地高辛和生物素标记S.tuberosum和S.chacoense基因组DNA，开展了双色GISH，对3C10-2（混倍体）、3C28-1(5x)和3C33-2(6x)三个体细胞杂种的双色GISH结果显示，在3个体细胞杂种染色体中，除能够观察到少数单色荧光信号外，大部分染色体均同时被S.chacoense的红色信号和S.tuberosum的绿色信号覆盖。表明采用GISH的方法不能直观地区分S.tuberosum和S.chacoense体细胞杂种中染色体的组成。该结果说明如果两个融合亲本亲缘关系较近，采用GISH技术很难鉴定杂种的染色体组分。
　　 马铃薯和茄子体细胞杂种的双色GISH结果显示，在供试的3个体细胞杂种中均能够清晰的鉴定出染色体的亲本来源，包括整条染色体和重排的染色体。进一步结合rDNA探针、端粒探针，在马铃薯和茄子的体细胞杂种中检测到了多种染色体重排现象，包括末端对末端的染色体融合、含有rDNA位点染色体的易位重排等。同时，在体细胞杂种60-10中还发现了2条具有双着丝粒的重排染色体，分别由端粒对端粒的末端融合和易位重排产生。另外，在60-13中1条重排染色体上的重排位点发现了ITR信号。结果表明，在GISH基础上结合丰富的细胞遗传学标记的检测方法是研究马铃薯和茄子体细胞杂种染色体组成的有效工具。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 文献综述

1．2．1 荧光原位杂交技术的原理和发展历程

1．2．2 探针荧光标记

1．2．3 探针类型

1．2．4 靶标分类

1．2．5 影响FISH质量的因素

1．2．6 FISH的应用

1．2．7 基因组原位杂交(GISH)的原理和应用

1．2．8 马铃薯细胞遗传学的发展

1．2．9 围绕S．tuberosum的细胞融合研究

1．2．10 茄属基因组的划分

1．2．11 内部端粒重复序列(Interstitial telomeric repeats，ITR)和功能着丝粒

1．3 研究目的与内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒、引物及合成的探针

2．1．3 序列克隆及分析

2．2 实验方法

2．2．1 染色体制片

2．2．2 DNA提取

2．2．3 封阻DNA制备

2．2．4 探针标记和检测

2．2．5 原位杂交及检测

2．2．6 Reprobe(再次杂交)

2．2．7 Dot blot(斑点分子杂交)

2．2．8 青枯病菌的分离及接种方法

3 结果与分析

3．1 原位杂交技术的优化

3．1．1 染色体制片材料预处理条件的优化

3．1．2 制片方法的改进

3．1．3 杂交前的染色体处理

3．1．4 探针的标记及标记效率检测

3．1．5 马铃薯BAC-FISH技术的优化

3．1．6 GISH体系的优化

3．2 基于BAC-FISH标记的马铃薯染色体核型

3．3 内部端粒重复序列在茄属的几个重要种中的特征分析

3．3．1 端粒重复序列在马铃薯、番茄和茄子染色体上的分布

3．3．2 端粒序列相对含量分析

3．3．3 ITR在马铃薯S．pinnatisectum粗线期染色体中的高分辨率定位

3．3．4 马铃薯A genome中含有杂合的内部端粒位点

3．4 不同茄属种rDNA研究

3．4．1 S．tuberosum、S．chacoense和S．melongena 5S rDNA基因的扩增与分析

3．4．2 马铃薯栽培种的25S rDNA基因的扩增

3．4．3 S．tuberosum、S．chacoense和S．melongena 5’ETS的扩增与分析

3．4．4 rDNA在茄属几个种染色体上的分布

3．5 SSR在马铃薯几个代表种和番茄染色体上的分布

3．6 基于GISH技术的体细胞杂种染色体组成分析

3．6．1 S．tuberosum+S．chacoense体细胞杂种染色体组成鉴定

3．6．2 S．tuberosum为探针的茄属代表genome染色体GISH分析

3．6．3 马铃薯和茄子体细胞杂种染色体组成的GISH分析

3．7 青枯病菌的分离及抗性鉴定

3．7．1 无菌试管苗青枯病抗性鉴定

3．7．2 茎枝菌液浸泡法鉴定青枯病抗性

4 讨论

4．1 荧光原位杂交技术的优化

4．2 以马铃薯为主的茄属染色体细胞学特征及染色体标记

4．2．1 马铃薯中部分ITR是功能着丝粒成分

4．2．2 rDNA的用途

4．2．3 寡核苷酸SSR在马铃薯染色体上的分散分布

4．2．4 更丰富的染色体细胞学标记

4．3 荧光原位杂交结合细胞学标记在体细胞杂种研究中的应用

4．3．1 不同genome的GISH区分

4．3．2 3C体细胞杂种染色体组成与青枯病抗性联系

4．3．3 杂种中rDNA的变化

4．3．4 杂种中的双着丝粒染色体

4．3．5 杂种中重排染色体着丝粒的亲本来源

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的论文

附录2

附录3

致谢