PtFLC选择性剪切本的遗传转化及功能分析

摘要

枳作为柑橘类植物唯一的落叶植物，需要经过冬季低温才能开花，这一现象与其体内春化途径关键基因的表达联系紧密。FLOWERING LOCUSC(FLC)是植物春化途径调控成花的中心基因。枳在不同发育时期FLC存在选择性剪切程序性改变，并获得了五个不同的FLC转录本，分别命名为PtFLCV1～PtFLCV5。其中，PtFLCV1和PtFLCV2在幼年期表达，PtFLCV4和PtFLCV5在成年期表达，而PtFLCV3在早实枳的整个发育阶段都有表达。
　　 本研究分别构建了PtFLCV1～PtFLCV5的超表达载体，并在早实枳及椪柑中超量表达，对不同转录本的表达进行了初步的分析及验证，旨在找出不同转录本之间可能存在的差异性功能。主要研究结果如下：⑴35S∷PtFLCV1～PtFLCV5超表达载体的构建及早实枳转化。构建了两种融合表达载体，包括35S∷PtFLCV1-GFP～PtFLCV5-GFP和35S∷PtFLCV1-FLAG～PtFLCV5-FLAG，并获得PtFL CV4-FLAG、PtFLCV5-FLAG超表达早实枳阳性植株。早实枳阳性植株经DNA水平PCR检测及RNA水平的表达分析获得证实。⑵超表达植株中PtFLC的表达分析。qRT-PCR结果表明，PtFLCV4和PtFLCV5的阳性植株均表现出了高表达量。与野生型对照相比，PtFLCV5的三株超表达植株中表达水平高达5000倍以上，而PtFLCV4超表达植株中FLC基因的表达量为野生型对照20～300倍。⑶超表达植株中PtSOC1、PtFT的表达分析。SOC1和FT为FLC的下游负调控靶基因。本研究检测结果显示:所有PtFLC超表达植株中PtSOC1的表达量与野生型对照相差一个数量级以上，表明PtSOC1严格响应PtFLC的负调控;而PtFT在两种不同转录本转化后代中下调程度不一致，可能与其转录本结构差异有关。⑷PtFLC-FLAG五个转录本转化椪柑胚性愈伤组织。经过筛选得到包括pCAMBIA1302、PtFLCV1、PtFLCV2、PtFLCV5四种转录本类型的抗性愈伤。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 植物成花调控的四条主要途径

1．2．1 光周期途径

1．2．2 自主途径

1．2．3 春化途径

1．2．4 赤霉素途径

1．3 FLC在植物开花时间调控网络的重要地位

1．4 植物转基因应用概述

1．4．1 农杆菌介导的遗传转化

1．4．2 转化受体系统的类型

1．4．3 转化载体插入基因

1．5 选择性剪切的相关研究

1．5．1 选择性剪切的进展

1．5．2 选择性剪切发生的频率和结果

1．5．3 选择性剪切影响蛋白复杂性及转录水平

1．5．4 选择性剪接对植物生物钟的影响

1．6 本研究的内容及意义

2 材料与方法

2．1 转化植物材料

2．2 菌株、质粒及试剂

2．3 载体构建

2．3．1 PCR扩增PtFLC不同转录本

2．3．2 扩增产物的回收、克隆及测序

2．3．3 大肠杆菌中质粒的提取

2．3．4 酶切

2．3．5 琼脂糖凝胶电泳及目的基因的回收

2．3．6 目的片段与表达载体连接

2．3．7 转化及质粒提取

2．3．8 融合载体转化农杆菌

2．3．9 菌落阳性检测

2．4 实验所用的各种培养基配方

2．4．1 细菌培养基

2．4．2 转化早实枳上胚轴所用各培养基配方

2．4．3 转化桠柑愈伤所用各培养基配方

2．5 根癌农杆菌介导的早实枳遗传转化

2．5．1 早实枳种子的无菌处理及上胚轴的培养

2．5．2 农杆菌菌液的复苏与准备

2．5．3 转化和共培养

2．5．4 潮霉素梯度筛选培养

2．5．5 抗性芽的获得及丛生芽的伸长生长

2．5．6 无菌苗的生根及移栽、嫁接

2．6 根癌农杆菌介导的柱柑愈伤遗传转化

2．6．1 胚性槿柑愈伤组织对潮霉素的敏感性分析

2．6．2 载体转化槿柑愈伤组织

2．6．3 潮霉素梯度筛选培养

2．6．4 抗性愈伤的扩繁及胚状体的诱导

2．7 转基因苗的分子生物学检测

2．7．1 DNA提取

2．7．2 PCR检测

2．7．3 RNA的提取

2．7．4 RNA质量检测及反转录

2．7．5 cDNA检测

2．8 转基因植株qRT-PCR分析

3 结果与分析

3．1 表达载体构建

3．2 转化早实枳上胚轴

3．2．1 早实枳上胚轴转化植株的筛选与再生

3．2．2 再生率与转化率统计

3．2．3 转化再生过程中的荧光检测

3．2．4 转基因植株的分子鉴定

3．2．5 转基因植株的qRT-PCR分析

3．2．6 转基因技术引起的异常表型

3．2．7 结瘤组织不定芽发生过程的细胞学观察及分析

3．3 转化桠柑愈伤

3．3．1 胚性桠柑愈伤对潮霉素的敏感性分析

3．3．2 转化桠柑抗性愈伤的获得与增殖

4 讨论

4．1 PtFLC选择性剪切的意义

4．2 早实枳实生苗茎段的遗传转化中筛选剂的使用

4．3 研究展望

参考文献

附录

致谢