“能饲一号”甜高粱BIBAC文库的构建与分析

摘要

双元细菌人工染色体(binarybacterialartificialchromosome，BIBAC)是一类可以在大肠杆菌与农杆菌中穿梭的载体，它除了可以构建大片段DNA文库，还可以将大片段DNA直接转入植物。它是基因图位克隆、功能分析等的重要工具，目前该项技术已经被广泛的运用。
　　 “能饲一号”甜高粱含有诸多的优良性状，构建“能饲一号”甜高粱BIBAC文库有助于筛选优良基因并将其转化入其它植物体中，突破物种间的隔离，从而对植物性状改良提供帮助。水稻是最重要的经济作物，选择水稻进行遗传转化具有深远的意义。
　　 本课题围绕水稻遗传转化展开准备工作，以“能饲一号”甜高粱嫩叶为材料，构建了BIBAC文库，并对文库进行了BIBAC末端测序以及BIBAC克隆在大肠杆菌、农杆菌中的稳定性检测。
　　 “能饲一号”甜高粱BIBAC文库总克隆数为51840，空载率为2.29％，平均插入片段大小为110.7kb，线粒体、叶绿体污染率分别为0.1％和2.2％，文库的覆盖度为7.65×(高粱全基因组大小为750Mb)。
　　 将144个克隆进行BIBAC末端测序，成功获得252个末端序列，末端测序成功率达到87.5％，平均长度为579.0bp，得到总长为145913bp的末端序列，占高粱全基因组大小的0.02‰。经Repeat-masker处理后，发现反转录因子(Retroelements)在重复序列中所占的比例最高，占总长的46.59％。参考高全基因组序列，对BIBAC末端序列进行了比对与定位，成功将66个BIBAC克隆定位到高粱基因组参考序列上。
　　 大肠杆菌稳定性检测结果表明:不同片段大小的BIBAC克隆在培养不同时间段后，片段大小均保持一致。在农杆菌的稳定性检测中，选取了10个大小不同的BIBAC克隆，其中9个克隆在农杆菌培养过程中保持稳定，1个克隆在两次稳定性检测中均表现出了不稳定性，猜测不稳定因素存在于农杆菌转化过程中而非农杆菌培养过程中。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 国内外研究现状分析

1．2．1 克隆载体的发展

1．2．2 BAC载体的应用

1．2．3 BIBAC载体的产生与应用

1．2．4 DNA测序技术的发展

1．2．5 遗传转化

1．2．6 农杆菌介导遗传转化的应用

1．2．7 农杆菌介导的遗传转化的稳定性

1．3 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验样品、实验菌株

2．2 实验仪器

2．3 试验方法

2．3．1 BIBAC载体的制备

2．3．2 适合大小片段DNA的制备

2．3．3 BIBAC文库构建

2．3．4 BIBAC文库初步分析

2．3．5 BIBAC在大肠杆菌与农杆菌体内的稳定性检测

2．3．6 BIBAC末端测序

3 结果与分析

3．1 载体制备

3．1．1 pHZAUBIBAC1质粒的提取

3．1．2 pHZAUBIBAC1质粒酶切

3．1．3 pHZAUBIBAC1质粒酶切后分离

3．1．4 电洗脱、BIBAC-S浓度检测

3．1．5 BIBAC-S载体质量检测

3．2 HMW基因组DNA的包埋块

3．3 预酶切

3．4 BIBAC文库的构建

3．4．1 一次筛选与二次筛选

3．4．2 电洗脱

3．5 BIBAC文库检测

3．5．1 BIBAC文库插入片段大小检测

3．5．2 BIBAC文库插入片段统计

3．5．3 BIBAC文库信息统计

3．5．4 BIBAC文库细胞器污染率的检测

3．6 BIBAC克隆在大肠杆菌、农杆菌的稳定性检测

3．6．1 BIBAC克隆在大肠杆菌中的稳定性检测

3．6．2 BIBAC克隆在农杆菌中的稳定性检测

3．7 BIBAC末端序列长度

3．8 BIBAC末端序列重复序列分析

3．9 BIBAC末端序列比对、定位

4 讨论

4．1 BIBAC载体的制备

4．2 高质量基因组DNA的制备

4．3 BIBAC克隆在农杆菌中不稳定性因素的探究

4．4 BIBAC末端测序结果的讨论

参考文献

发表的会议摘要与文章

致谢