土拉霉素对离体恒化器模型中人肠道菌群的影响

摘要

土拉霉素作为新一代大环内酯类动物专用抗生素具有药效持久，消除半衰期长等众多优点，同时土拉霉素在牛和猪可食性组织中残留对食品安全和人体健康可能带来不利影响也值得关注。目前国内外对土拉霉素残留的微生物安全性评价尚有不足之处，EMEA，FDA和APVMA关于其微生物学NOAEL/NOAEC的确定仅局限于短期的体外药敏试验中对肠道菌MIC50的测定，缺乏土拉霉素长期作用于人体肠道菌可能带来不利影响的资料，如肠道菌群数量与结构、菌群代谢，定植屏障功能和耐药性变化等指标。作为新兽药一些潜在的毒副作用尚未充分体现出来，因此有必要进行土拉霉素残留对人肠道菌群影响的系统全面的研究，从而为制定更合理的ADI提供参考数据。同时在药物长期选择压力下，人肠道条件致病菌的耐药性和毒力特性可能发生变化，对人体健康存在潜在的致病性和危害性，本研究选择粪肠球菌为目标菌，阐释细菌耐药、毒力的变化和联系，以及细菌致病能力的变化。
　　 1土拉霉素对人肠道菌两个微生物学端点的影响
　　 本研究采用体外连续培养的恒化模型来评估土拉霉素对人肠道菌群的影响，根据官方报告中土拉霉素对肠道菌MIC50值(EMEA，1.5μg/mL;APVMA，1μg/mL)和体外预实验结果最终确定模型中土拉霉素的添加浓度分别为0，0.1，1，10和100μg/mL共5个浓度。对给药前后两个重要的微生物学端点定植屏障功能和耐药性的变化进行考察，定植屏障功能变化包括三个指标，四种优势菌数量变化，代谢产物短链脂肪酸的变化和致病菌沙门氏菌的定植。
　　 实验结果为，在低剂量组(0.1和1μg/mL)，肠道菌群的定植屏障功能和耐药性各指标均处于95％置信区间内，对肠道菌群无显著性影响。中浓度组(10μg/mL)，肠球菌和脆弱拟杆菌的数量分别第18和16d后呈现显著性降低，细菌数量比95％置信下限分别降低了大约1.6和6倍，其他细菌数量在正常范围内，短链脂肪酸中只有丙酸含量稍低于95％置信下限，未见鼠伤寒沙门氏菌的定植，肠球菌和脆弱拟杆菌的耐药率呈现轻微上升的波动，说明此浓度下对肠道菌群屏障功能和耐药性产生了轻微的影响。高浓度组(100μg/mL)大肠杆菌和双歧杆菌的数量较95％置信下限降低了6倍左右，脆弱拟杆菌数量降低了近100倍，肠球菌的数量却呈现增长趋势，短链脂肪酸乙酸，丙酸和丁酸的浓度分别降低了大约1.3，1.3和2.7倍，侵袭菌鼠伤寒沙门氏菌细菌数量维持在105-106CFU/mL，实现了稳定生长，以上均说明在了高浓度组肠道菌群的屏障功能受到显著性影响，造成了菌群紊乱和失调。结合本实验结果和文献报道，推测肠道菌群的定植屏障功能可能与肠杆菌科的数量变化密切相关。同时，在药物作用下大肠杆菌，肠球菌和双歧杆菌的耐药率均呈现显著性提高，肠球菌和双歧杆菌的耐药率甚至达到了80％，土拉霉素对肠道菌群耐药性的影响比其对定植屏障功能影响更加明显。
　　 在1μg/mL下，肠道菌群耐药性和屏障功能均未发生显著性变化，因此其对人肠道菌群的最大无明显副作用浓度(NOAEC)为1μg/mL，根据VICH的ADI计算公式得到其对人肠道菌群影响的微生物学ADI值为4.58μg/kg.bw/day(0.27mg/person/day)，低于FDA(50μg/kg.bw/day)，EMEA(10.97μg/kg.bw/day)和APVMA(5μg/kg.bw/day)已经制定的微生物学ADI值。
　　 2土拉霉素对粪肠球菌耐药性和毒性的影响
　　 对药物作用前后粪肠球菌进行分离鉴定，测定药物作用前后粪肠球菌耐药表型、基因型和耐药转移能力的变化，同时，对肠球菌中五种毒力因子表面蛋白esp，细胞溶血素cylA，明胶酶gelE，胶原结合蛋白ace和聚集蛋白asal进行测定，考察细菌毒性变化和对小鼠的致病能力，并且分析细菌耐药性和毒性的关系。
　　 实验结果为，在土拉霉素作用前后，粪肠球菌对土拉霉素的MIC50值由4.904升高到244.149，提高了49.8倍，同时对大环内酯类、林可胺类和链阳菌素B菌呈现高水平交叉耐药，耐药表型为典型的MLSB，且主要是由ermB基因介导相关(阳性率达到88.46％)，而ermB基因基本上全部位于转座子Tn1545内，肠道菌耐药性的显著性提高，很可能与转座子Tn1545介导的ermB基因的转移密切相关。
　　 药物作用后，粪肠球菌中一些毒力因子的表达也呈现明显的变化，毒力因子esp和cylA的检出率显著性提高（由0升至70％），gelE的检出率却呈现显著减低（由61.76％降至20％），同时ermB与esp，cylA之间存在明显的正相关关系，与gelE基因间存在着明显的负相关关系。推测在转座子Tn1545的附属基因区内可能同时含有耐药基因ermB和毒力因子esp、cylA、gelE，受到相同调控区基因的调控，粪肠球菌利用可接合复合型转座子Tn1545实现耐药基因和毒力因子的积累。
　　 含有毒力因子esp，cylA的耐药粪肠球菌的毒性强于毒力因子阴性的菌株，腹腔攻毒后前者造成小鼠急性死亡死的时间集中在8h内，后者造成小鼠的死亡时间相对延后，主要集中24h以内，半数致死量LD50后者是前者的3.8倍，细菌在小鼠体内广泛分布。在不利环境中，esp基因有助于细菌生物膜的形成，有助于其在宿主体内的吸附和定植，有效避免了宿主免疫系统的对细菌的清除。细菌在小鼠体内快速大量增殖，引起急性腹膜炎和心内膜炎等并诱发败血症，造成小鼠死亡。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题依据

1．2 国内外研究进展

1．2．1 兽药残留的微生物学ADI的制定

1．2．2 土拉霉素微生物安全性评价

1．2．3 肠球菌的耐药性和毒力

1．3 研究内容、目的意义和技术路线

1．3．1 研究内容

1．3．2 目的和意义

1．3．3 实验技术路线

2 材料与方法

2．1 抗菌药物及其配制

2．2 实验菌株和动物

2．3 仪器设备

2．4 培养基和试剂

2．4．1 实验用培养基、试剂及其配制

2．4．2 恒化器中肠道菌群用培养基

2．4．3 SCFA标准品、试剂和PCR试剂

2．5 土拉霉素添加剂量的确定及给药

2．6 肠道菌群培养基对药物的影响和浓度确证

2．6．1 肠道菌群培养基对药物抗菌活性的影响

2．6．2 肠道菌群培养基中药物浓度的确证

2．7 恒化器模型的运行

2．7．1 灭菌和组装

2．7．2 接种和培养

2．7．3 时间和安排

2．8 土拉霉素对人肠道菌群的影响

2．8．1 四种优势菌数量变化的测定

2．8．2 短链脂肪酸(SCFA)变化的测定

2．8．3 鼠伤寒沙门氏菌的定植

2．8．4 四种优势菌耐药率变化的测定

2．9 粪肠球菌的分离和鉴定

2．9．1 细菌的分离和编号

2．9．2 细菌的生化鉴定

2．9．3 细菌的PCR鉴定

2．10 粪肠球菌耐药表型和基因型的测定

2．10．1 药物作用前后细菌耐药表型变化的测定

2．10．2 药物作用前后细菌耐药基因型变化的测定

2．11 粪肠球菌耐药性转移的测定

2．11．1 复合型转座子Tn1545和Tn917的测定

2．11．2 供体菌的受体菌的选择

2．11．3 滤膜接合转移和肉汤转移试验

2．12 粪肠球菌毒力因子和毒性的测定

2．12．1 药物作用前后细菌毒力因子的测定

2．12．2 血平板溶血环试验

2．12．3 紫外分光光度计测定血红素试验

2．12．4 药物作用前后细菌生物膜形成试验

2．13 粪肠球菌的小鼠急性毒性实验

2．13．1 粪肠球菌143和174生长曲线的测定

2．13．2 实验小鼠分组和菌液制备

2．13．3 小鼠死亡情况统计和LD50的测定

2．14 粪肠球菌在小鼠体内分布实验

2．14．1 实验小鼠分组和取样

2．14．2 细菌的检测和鉴定

2．15 数据处理及分析

3 结果与分析

3．1 土拉霉素添加剂量的预实验

3．2 肠道菌群培养基对药物的影响和浓度确证

3．2．1 肠道菌群培养基对药物抗菌活性的影响

3．2．2 肠道菌群培养基中药物有效抗菌浓度的确证

3．3 土拉霉素对人肠道菌群的影响

3．3．1 四种优势肠道菌数量变化的测定

3．3．2 短链脂肪酸(SCFA)变化的测定

3．3．3 鼠伤寒沙门氏菌的定植

3．3．4 四种优势肠道菌耐药率变化的测定

3．4 粪肠球菌的分离与鉴定

3．4．1 粪肠球菌的生化鉴定

3．4．2 粪肠球菌的PCR鉴定

3．5 粪肠球菌耐药表型和基因型的测定

3．5．1 粪肠球菌药物敏感性的变化

3．5．2 粪肠球菌耐药基因型的测定

3．6 粪肠球菌耐药性转移的测定

3．6．1 复合型转座子Tn1545和Tn917的测定

3．6．2 滤膜接合转移和肉汤转移

3．7 粪肠球菌毒力因子和毒性测定

3．7．1 毒力因子测定结果

3．7．2 耐药和毒力的关系

3．7．3 细菌毒性的验证

3．8 粪肠球菌的小鼠急性毒性实验

3．8．1 小鼠病理变化和LD50计算

3．8．2 粪肠球菌在小鼠体内的分布

4 讨论

4．1 土拉霉素对肠道菌屏障功能的影响

4．1．1 肠道菌群的屏障功能和意义

4．1．2 肠道菌群数量的变化

4．1．3 短链脂肪酸(SCFA)的变化

4．1．4 鼠伤寒沙门氏菌的定植

4．2 土拉霉素对肠道菌耐药性的影响

4．2．1 肠球菌的耐药表型和基因型

4．2．2 肠球菌耐药转移机制

4．3 土拉霉素残留微生物学ADI的确定

4．4 肠球菌耐药和毒力的关系

4．5 耐药肠球菌的致病性

5 小结

文献综述 土拉霉素概述和大环内脂类耐药研究进展

参考文献

致谢

附录