华中地区猪群腹泻相关病毒的病原分子流行病学研究

摘要

腹泻是临床上一种常见的疫病，常引起动物机体脱水而死亡。2010年以来，生猪的腹泻疫情在全国许多省份发生，发生疫情的猪场7日龄以内的仔猪发病率可达到100%，死亡率也可高达80%～100%，并在许多地区持续呈现一种流行态势，使我国养猪业面临前所未有的严峻形势。引起猪腹泻的病原多种多样，包括病毒，细菌，寄生虫等，但病毒性病原在这次疫病中占主要因素。常见的病毒性腹泻病原有猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪A群轮状病毒(GARV)，以及猪库布病毒(PKoV)和猪博卡病毒(PBoV)这两种新发病毒。本研究通过对猪群中这五种病毒的流行情况进行病原学检测，分析了2011年2月～2012年2月期间华中地区不同猪场送检的不同阶段猪群腹泻样本携带相关病毒的现状与分子差异，旨在为猪群腹泻疫病的防控提供参考意义。
　　1.病毒性腹泻相关病原的流行病学调查
　　2011年2月～2012年2月，实验室从华中地区部分省份的143家猪场收集不同年龄阶段猪群的腹泻样品(粪便和肠道内容物)总共985份，同时收集健康猪群的粪便样品324份。利用RT-PCR对采集的样品进行常规肠道病毒的检测。在腹泻猪样品中，PEDV、PKoV、PBoV、GARV、TGEV的检出率分别为81.9%，75.3%，31.2%，9.6%，0.6%。值得注意的是，腹泻样品混合感染的比例非常高，达到了72.3%(P<0.001)，其中二重、三重、四重感染样品分别占到43.9%，26.1%，2.3%。所有这些混合感染总共分为13种感染模式，PEDV+PKoV(35.9%)感染模式最常见，且在3周龄以内的仔猪及母猪群体中的感染频率最高(P<0.001)。在健康猪样品中PEDV的检出率为10.8%，PKoV检出率为37.7%，检出率显著低于腹泻样品。PBoV在健康猪群也有检出，但与腹泻猪群的检出率没有太大差异。
　　2. PEDV S基因和PKoV VP1基因的序列分析
　　利用PCR对华中地区不同猪场检出的PEDV流行毒株的S基因进行扩增并测序，进一步用 Clustal X软件对 S基因推导的氨基酸序列进行多序列比对，同时用MegAlign软件进行同源性分析。结果表明：与经典株PEDV CV777和LZC-2007相比，95%的测序毒株存在变异，具体表现在S1 domain的最N端处有不连续的几个氨基酸的增加或缺失；氨基酸序列和中国经典毒株LZC-2007的同源性不高于90%；与韩国在2007年报道的毒株同源性约为90%，而与韩国2010年报道的毒株同源性在91.3～96.7%之间。对PKoV流行毒株的VP1基因序列进行分析，表明临床上流行的PKoV VP1同源性很低，抗原漂移频繁发生，临床测序样品之间的核苷酸序列同源性大多不高于90%，最低为81.2%。
　　3.利用荧光定量PCR的方法比较腹泻猪群及健康猪群病毒含量的差异
　　为了解PEDV、PKoV和PBoV在此次腹泻疫情中的致病性作用，本研究进一步建立了针对PEDV、PKoV和PBoV的荧光定量PCR的方法，并分别对腹泻猪群及健康猪群相关样本所含病原的含量进行了比较分析。结果显示在腹泻猪群中，PEDV的平均载毒量高于PKoV和PBoV(7.9×106 versus3.1×105 and4.6×105 copies/g of stool, respectively)，且PEDV在母猪群体的病毒含量最高，达到了1.97×107 copies/g。值得注意的是，PEDV在腹泻猪群中的平均载毒量稍高于健康猪群(7.9×106 versus2.0×105 copies/g of stool)，而PKoV和PBoV在两群体中的平均载毒量则没有明显的差异(3.1×105 versus1.5×105 and4.6×105 versus2.9×105 copies/g of stool, respectively)。

目录

声明

缩略词(Abbreviation)

1 文献综述

1.1猪群腹泻疫病概述

1.2 腹泻疫病的分类及致病机制

1.2.1 病毒性腹泻

1.2.2 细菌性腹泻

1.2.3 寄生虫性腹泻

1.2.4 营养性腹泻

1.2.5 管理性腹泻

1.3 病毒性腹泻的病原学

1.3.1 猪流行性腹泻病毒

1.3.2 猪传染性胃肠炎病毒

1.3.3 猪轮状病毒

1.3.4 猪库布病毒

1.3.5 猪博卡病毒

1.4 病毒性腹泻的诊断研究

1.4.1 病原学诊断

1.4.2 血清学诊断

1.4.3 分子生物学诊断

1.5 腹泻疫病的综合防控措施

1.5.1 疫苗免疫

1.5.2 防治

2 研究的目的和意义

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 病料来源与试验动物

3.1.2 载体、工具酶及其它试剂

3.1.3主要试剂和溶液的配制

3.1.4 引物设计

3.1.5主要实验器材

3.1.6 统计与分子生物学分析软件

3.2 实验方法

3.2.1 样品采集及信息记录与样品处理

3.2.2猪腹泻病毒PCR/RT-PCR检测方法的建立

3.2.3 猪腹泻病毒检测结果分析

3.2.4组织病理学及免疫组织化学检查

3.2.5 PEDV的S基因扩增与测序

3.2.6 PKoV的VP1基因扩增与测序

3.2.7 阳性标准质粒的构建

3.2.8荧光定量PCR检测方法的建立

4 结果与分析

4.1 猪腹泻病毒PCR/RT-PCR检测方法的建立

4.2.1 腹泻相关病毒在不同阶段猪群中的流行情况

4.2.2 腹泻相关病毒的感染模式

4.2.3 猪病毒性腹泻的季节相关性

4.3.1 组织病理学分析结果

4.3.2免疫组织化学分析结果

4.4 PEDV的S基因的测序及序列分析结果

4.4.1 PEDV S基因的PCR扩增结果

4.4.2 PEDV S基因的序列分析结果

4.5 PKoV的VP1基因的测序及序列分析结果

4.5.1 PKoV VP1基因的PCR扩增结果

4.5.2 PKoV的VP1基因序列分析结果

4.6 阳性标准质粒的鉴定

4.6.1 目的基因片段的扩增、克隆

4.6.2 阳性标准质粒的构建与鉴定

4.7 荧光定量检测结果

4.7.1 标准曲线的绘制

4.7.2 临床样品的定量检测

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

致谢