免疫基因网络的构建和评估及在猪抗病育种高通量数据中的初步应用

摘要

免疫系统的正常工作对于机体健康具有重要作用，免疫系统的失职、失察或者过激反应都会引发感染或者其他疾病。由于免疫系统组成和反应的复杂性，同时受限于生物实验技术和实验结果分析方法，使得复杂疾病的诊断、解释和动物育种有效分子标记的开发成为生物医学和动物育种的重点和难点。各种高通量生物技术的发展，特别是以蛋白质互作网络和基因调控网络为代表的生物网络显示了很好的基因间的复杂作用关系，为复杂疾病和动物抗病育种提供了大量可靠的数据支持。目前，高通量数据的获取不再困难，研究人员面临的挑战是如何在生物医学和动物遗传育种研究过程中运用这些数据。
　　 本研究旨在发展高通量的免疫基因组学分析平台和方法，在哺乳动物全或近全免疫基因组数据的收集、整理的基础上，通过全或近全免疫基因网络的构建与评估，深入解析了动物免疫基因组的特点，并将免疫基因组/免疫网络作为工具，初步运用于表达谱和GWAS。主要结果和发现如下:
　　 1.全或近全免疫基因组数据的收集、免疫基因网络的建立与评估
　　 原始数据主要来源于6个蛋白质数据库(BioGRID、InAct、HPRD、Innatedb、Reactome、MINT)和4个基因通路数据库(NCI/Nature pathway interaction、IMID、HumanCyc、Cancer cell map)。通过SIF格式进行数据转化、统一与整合，同时利用功能互作网络（Functional Interaction Network）对数据整合的有效性进行评估和再次整合，最后建立了一个包含16219个基因和984215个互作对的全基因互作网络。
　　 在此基础上，从4个免疫基因数据库(Immport，IRIS，Immtmome Database andInnatedb curated genes)和相关文献中对免疫基因做了系统的收集和整理，共得到了8806个免疫功能相关基因(immune functional related genes)。
　　 利用免疫功能相关基因，从全基因互作网络(whole genome interadtion network)中钓取免疫基因相关的互作信息。利用该策略，我们分别得到了开放式免疫基因网络（open immune gene network）与封闭式免疫基因网络(closed immune gene network)的基础数据。在开放式免疫基因网络中，6816个免疫基因与15727个基因存在817419个互作对，而封闭式免疫基因网络包含6732个免疫功能基因和375472个免疫基因互作对。利用免疫基因子集覆盖度方法对免疫基因网络进行评估。发现在免疫基因数目较少的情况下，免疫基因数目对免疫基因网络节点的全面性影响较小而对网络中边的丰富性影响较大。当免疫基因个数达到一定数目之后，再增加免疫基因对于免疫网络节点和边的全面性影响都非常小。同时还发现某些免疫基因子集(immunegene subsets)的影响远远大于其他免疫基因子集对于整个免疫网络的组成的影响。
　　 我们进一步对封闭式免疫基因网络的拓扑学参数(topological parameters)进行了估计，发现在6732个免疫基因中，有1740个免疫基因在网络拓扑结构中的连接数目超过100，其中有67个免疫与其他免疫基因之间的连接数超过1000，免疫网络中约有1％的基因成为“超级连接”节点。
　　 2.免疫基因组数据在基因表达谱芯片分析中的应用
　　 我室建立了用于免疫性状研究的杜洛克-二花脸F2分离群体，所测定免疫性状包括在PolyI∶C刺激前后，外周血细胞因子水平和T淋巴细胞比例（数目）变化。我们利用免疫基因组数据，对PolyI∶C刺激前后，IFN-a水平两尾个体的免疫基因表达谱开展了差异表达基因与基因集富集分析(GSEA)分析。
　　 首先，我们对IFN-a应答高组(High group)（23对）和低组(Low group)（24对）的全血表达谱芯片(whole blood transcriptome)进行了差异表达基因分析(differentialexpression gene analysis)（PValue≤0.01，adj.P.Val≤0.05，LogFC≥1）。在高组中得到了344个下调表达基因（370探针）和357上调表达基因（450探针）。在低组中一共得到386个下调表达基因(426探针)和251个上调表达基因（306探针）。有5个基因ETV6，DMD，SMARCC1，AKAP9和SDHB在其中一组或两组中存在差异表达探针(differential expression probe)。差异表达基因的GO分析显示两组中的上调表达基因都集中在免疫抵抗、炎症、损伤抵抗过程(defense response，response tovirus，inflammatory response);细胞凋亡、程序性死亡调控过程(regulation of apoptosis，regulation of programmed cell death，regulation of cell death);下调表达基因都集中在血细胞发生和淋巴细胞活化与分化(cell proliferation，T cell activation，lymphocyteactivation，lymphocyte differentiation)。高组在免疫抵抗、炎症、损伤抵抗过程(defenseresponse，response to virus，inflammatory response)比低组更加强烈，低组可能存在一个额外的蛋白激酶（regulation of kinase activity）上调基因群。
　　 其次，基于基因集富集分析(GSEA)的基因通路分析，在两组内都未能得到差异显著的基因通路。通过比较高组和低组差异最明显的前10条基因通路发现，高组和低组上调基因通路中前10条通路7条都集中在干扰素相关(interferon relatedpathways)通路，下调基因通路却显示很大的不同。High组中的基因通路主要涉及的有蛋白质代谢(Reactome metabolism of proteins)、不饱和脂肪酸代谢(biosynthesis ofunsaturated fatty acids)、TCA循环的电子转移(TCA cycle and respiratory electrontransport)以及T细胞受体通路(TCR pathway)。Low组中的基因通路涉及的生物学过程比较分散，蛋白质代谢中的蛋白质折叠(protein folding)、DNA复制(DNAreplication)以及血液系统疾病通路(Hematological Disease pathways)，包括镰刀形红细胞病以及急性T淋巴细胞白血病的复发预后(Jison sickle cell disease，Chiaretti TALL relapse prognosis)。
　　 3.免疫基因网络在GWAS结果注释中的应用
　　 用GAPPIT软件对PolyI∶C刺激前、后的外周血T淋巴细胞亚型（比例）数目和CD4∶CD8 T细胞比率进行了全基因组关联分析(GWAS)。CD4 T细胞数目和CD4∶CD8 T细胞比率共同锁定到了猪的5号染色体一段大约8.4M的区域，在最新的基因组注释版本中这段区域中包括153个基因。为了进一步缩小候选基因范围，我们将锁定区域内的基因和免疫基因网络结合分别建立了CD4 T细胞表型包括131个基因和18022个互作和CD4∶CD8 T细胞比率包括126个基因和16235个互作的“致因网络”，并将“致因网络”用于候选基因推断。通过对“致因网络”拓扑学参数估计结果，综合判断ETV6、GAPDH基因内的SNP或与ETV6，GAPDH基因SNP紧密连锁的位点最可能为致因位点。
　　 本文通过公共数据库整合和文献挖掘的方法建立了动物免疫基因组学数字化分析平台。通过对基因网络的评估从某种方面说明了免疫基因网络的全面性，同时发现了免疫基因网络的拓扑学结构特征。将建立的免疫基因网络应用到了两个我室的第一手猪抗病育种高通量表达谱芯片和SNP芯片的分析。免疫基因网络分析为大样本表达谱芯片在差异基因表达分析和基因通路分析后得不到一致性结果的情况下提供了更多的推断信息。免疫基因网络结合GWAS定位区段基因得到的“致因网络”分析为GWAS候选基因的进一步提供了可靠的信息推断。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(ABBREVIATIONS)

1 绪论

1．1 前言

1．2 系统生物学与基因网络生物学

1．2．1 系统生物学的定义

1．2．2 生物网络类型

1．2．3 生物网络的获取方法

1．2．4 生物网络的特征

1．2．5 生物网络在后基因组时代的应用

1．3 本文的研究内容与创新

1．4 本文的内容写作安排

2 免疫基因网络的构建、评估

2．1 前言

2．1．1 问题的由来

2．1．2 免疫基因网络概述

2．1．3 免疫基因网络建立的假设

2．1．4 免疫基因网络的作用、目的及意义

2．2 材料与方法

2．2．1 生物网络数据

2．2．2 免疫基因数据

2．2．3 免疫基因网络的构建

2．3．4 免疫基因网络的评估

2．3 实验结果

2．3．1 互作数据的收集与整理

2．3．2 免疫基因的收集与整理

2．3．3 免疫基因网络的构建

2．3．4 免疫基因网络的评估

2．3．5 免疫基因网络的可靠性和全面性评估

3 免疫基因网络应用于高通量表达谱基因芯片

3．1 前言

3．1．1 问题的由来

3．1．2 文献综述

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验动物群体及设计

3．2．2 实验材料

3．2．3 试验方法

3．3 实验结果

3．3．1 差异表达基因分析

3．3．2 基因集富集分析(GSEA)

4 免疫基因网络应用于猪外周血淋巴细胞亚型全基因组关联分析(GWAS)和转录组芯片的整合分析研究

4．1 前言

4．1．1 问题的由来

4．1．2 关于血液表型的GWAS研究综述

4．1．3 T淋巴细胞及亚群在临床诊断当中的应用

4．1．4 关于淋巴细胞的全基因组关联分析(GWAS)进展

4．1．5 全基因组关联分析进展及碰到的问题

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验动物群体及设计

4．2．2 试验材料

4．2．3 实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 PolyI：C刺激前后T细胞亚型表型的变化

4．3．2 各类型细胞表型的GWAS结果

4．2．3 区域内候选基因致因网络的构建

4．2．4 GWAS显著区间内候选基因的网络分析

5 讨论

6 小结

参考文献

攻读硕士期间完成的其它工作

攻读学位期间撰写论文题录

致谢