IGFs基因沉默对梅花鹿鹿茸软骨及间充质细胞生长发育的作用机制研究

摘要

本研究以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid为载体，以IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ作为候选基因研究其对鹿茸生长的作用机制，针对候选基因各构建三个RNAi重组质粒，分别命名为pshRNA1-1、pshRNA1-2、pshRNA1-3和pshRNA2-1、pshRNA2-2、pshRNA2-3，转染至软骨细胞及间充质细胞。应用Real-Time PCR和Western blot技术，对转染48h后的RNAi效果进行分析，筛选得到抑制效果最好的干扰组。用于研究目的基因对鹿茸软骨细胞及间充质细胞增殖、凋亡、周期及自身mRNA和蛋白表达的作用，探讨鹿茸生长调节机制。研究内容和结果如下:
　　 (1)所构建的三个IGF-ⅠRNAi质粒均可显著降低鹿茸软骨细胞及间充质细胞目的基因的表达量。其中，pshRNA1-1、pshRNA1-2、pshRNA1-3分别降低了IGF-Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平，且pshRNA1-2的干扰效果最好，对IGF1 mRNA的抑制率达到60％以上。
　　 (2)所构建的三个IGF-ⅡRNAi质粒均可显著降低鹿茸软骨细胞及间充质细胞目的基因的表达量。其中，pshRNA2-1、pshRNA2-2、pshRNA2-3分别降低IGF-Ⅱ的mRNA表达水平，且pshRNA2-2的干扰效果最好，对IGF2 mRNA的抑制率达到60％以上。
　　 (3)采用MTT方法检测转染48h细胞的增殖情况，软骨细胞实验组pshRNA1-2和pshRNA2-2、空白对照组、阴性对照组的增殖率分别为16.97±9.83％、19.13±8.11％、24.59±10.22％、22.11±10.19％;间充质细胞实验组、空白对照组、阴性对照组的增殖率分别为22.63±11.22％、23.46±12.77％、29.46±12.88％、28.02±15.69％;结果表明软骨细胞和间充质细胞的增殖均受到抑制。
　　 (4)应用(V)-APC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测转染后软骨细胞的凋亡情况，发现转染48h后，空白对照组、实验组pshRNA1-2、pshRNA2-2和阴性对照组pshRNA-negative的早期凋亡率分别为0.46±0.39％、14.45±3.39％、23.64±2.81％、0.67±0.24％，差异极显著(p＜0.01);间充质细胞转染48h后空白对照组、实验组pshRNA1-2、 pshRNA2-2和阴性对照组pshRNA-negative的早期凋亡率分别为4.40±2.05％、25.78±5.87％、38.15±16.66％、6.32±3.03％，差异极显著(p＜0.01)。表明转染pshRNA1-2和pshRNA2-2可以促进软骨细胞及间充质细胞凋亡。
　　 (5)利用流式细胞仪分析转染后48h碘化吡啶处理的细胞，检测细胞的周期变化情况。结果显示:软骨细胞空白对照组S期比例为12.59±0.04％;试验组pshRNA1-2、pshRNA2-2为7.19±0.03％、7.12±0.05％;阴性对照组为8.70±0.03％。间充质细胞空白对照组S期比例为9.47±3.56％;实验组pshRNA1-2、 pshRNA2-2为4.95±0.48％、3.48±4.74％;阴性对照组为8.28±2.98％。发现无论是在软骨细胞还是间充质细胞中，pshRNA1-2和pshRNA2-2均可使S期细胞减少。
　　 结果表明，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在鹿茸的生长过程中起着重要的调控作用，特别是对鹿茸软骨及间充质细胞的增殖、凋亡有显著的调节作用，其次通过调控软骨及间充质细胞的细胞周期（G1至S期的过渡期）影响其生长发育。此外，对其自身的mRNA和蛋白表达水平的调节有显著影响。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation words)

1 前言

1．1 梅花鹿的概述

1．1．1 概述

1．1．2 鹿茸的化学成分

1．2 IGF-Ⅰ的研究概况

1．2．1 IGF-Ⅰ的结构

1．2．2 IGF-Ⅰ的作用机理及与鹿茸生长的研究

1．3 IGF-Ⅱ研究概况

1．3．1 IGF-Ⅱ的结构

1．3．2 IGFs受体和结合蛋白

1．3．3 IGF-Ⅱ的生理功能与鹿茸生长的研究

1．4 RNA干扰技术研究概况

1．4．1 RNAi的基本概念

1．4．2 分子机制

1．4．3 siRNA导入哺乳动物体内的方法

1．5 RNAi技术及其应用

1．5．1 基因功能的研究

1．5．2 转基因动物的研究

1．5．3 抗病毒作用

1．5．4 抗肿瘤作用

1．5．5 药物开发

1．5．6 研究信号传导的新途径

1．6 RNAi技术的应用前景

1．7 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 样本采集

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 干扰载体

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要溶液及相关缓冲液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 鹿茸软骨细胞及其间充质细胞的分离和培养

2．2．2 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因RNAi重组干扰质粒的构建

2．2．3 重组质粒克隆及提取

2．2．4 重组质粒转染鹿茸软骨细胞和间充质细胞

2．2．5 实时荧光定量PCR(QPCR)

2．2．6 转染后软骨及间充质细胞相关蛋白的Western blot分析

2．2．7 转染后软骨及间充质细胞增殖检测

2．2．8 转染后软骨及间充质细胞凋亡检测

2．2．9 转染后软骨及间充质细胞周期检测

2．3 统计分析

3 结果与分析

3．1 重组质粒的构建及其鉴定

3．2 重组质粒转染软骨及间充质细胞的转染效果检测

3．3 细胞总RNA的检测

3．4 重组质粒的效果鉴定

3．5 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ沉默抑制软骨及间充质细胞增殖

3．6 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ沉默诱导软骨及间充质细胞凋亡

3．7 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ沉默影响软骨及间充质细胞周期

4 讨论

4．1 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ对软骨细胞及间充质细胞生长发育的影响

4．2 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ对软骨细胞及间充质细胞生长周期的影响

4．3 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ引起软骨细胞及间充质细胞凋亡的作用机制

5 小结

参考文献

致谢