抗除草剂基因DsALS转化拟南芥和甘蓝型油菜的研究

摘要

油菜（Brassica napus）是我国继大豆之后的第二大油料作物，提高油菜的产量和品质具有十分重要的意义。杂草是制约油菜生产的主要因素之一，严重降低油菜的产量和品质。目前，利用化学除草剂是清除农田杂草的主要方法，但是它在杀死杂草的同时也对农作物的生长造成了一定的影响。为了改良油菜抗除草剂的遗传特性，本研究采用下胚轴作为外植体，通过农杆菌介导法将抗除草剂的乙酰乳酸合成酶基因转入甘蓝型油菜中双9号和甲572，获得了转基因植株，为选育抗除草剂的油菜品种提供了育种材料。本研究的结果如下:
　　 1.从播娘蒿野生型和两个抗苯磺隆除草剂的天然突变体中克隆了ALS基因（分别命名为DsALS-1、DsALS-97、DsALS-108，经测序分析后与拟南芥中ALS序列进行比对，发现DsALS-97和DsALS-108序列中的197位的脯氨酸被分别替换为丝氨酸和苏氨酸，这种突变会对ALS抑制剂产生抗性，而在DsALS-1序列中不存在相应的突变。
　　 2.将克隆的三个DsALS基因构建植物表达载体转化拟南芥，利用T3代纯合转基因植株进行抗性鉴定。转DsALS-97和DsALS-108基因的植株对苯磺隆产生抗性，转DsALS-1基因的植株不具有抗性，抗性鉴定结果与测序结果相一致。
　　 3.选用抗苯磺隆除草剂的基因DsALS-108，以Bar基因作为筛选标记基因来构建植物表达载体，采用农杆菌介导的下胚轴转化法对甘蓝型油菜中双9号和甲572进行遗传转化。以中双9号为受体获得23棵转基因植株，阳性率为12.4％;以甲572为受体获得19棵转基因植株，阳性率为22.4％。
　　 4.对T1代转基因株系随机取样提取DNA进行PCR检测，结果表明外源基因在T1代发生分离，且在转基因后代中能够稳定遗传。用RT-PCR检测分析了T1代阳性植株，从转录水平上证实了外源基因在转基因后代中能够稳定表达。
　　 5.使未转化甘蓝型油菜致死的最低苯磺隆浓度为2.5×10-3g/L。用2.5×10-3g/L、5.0×10-3g/L和7.5×10-3 g/L三个浓度对T1代株系和对照进行喷洒，未转化的对照植株死亡，转基因植株生长正常，表明转基因油菜具有很强的抗性。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 我国油菜的生产现状及存在问题

1．2 转基因技术在油菜遗传改良中的应用

1．2．1 油菜品质改良

1．2．2 油菜抗性改良

1．3 ALS与ALS抑制剂的研究进展

1．3．1 ALS与ALS抑制剂

1．3．2 ALS氨基酸序列中与抗除草剂相关的位点

1．3．3 抗除草剂ALS突变基因在播娘蒿中的研究进展

1．4 表达载体构建的方法

1．4．1 传统的载体构建方法

1．4．2 Gateway技术

1．4．3 多基因表达载体的构建方法

1．5 油菜转化的主要方法

1．5．1 直接转化法

1．5．2 农杆菌介导法

1．6 研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体和菌株

2．1．3 主要试剂

2．1．4 抗生素，激素及其它试剂的浓度和配置方法

2．1．5 转化培养基的配制方法

2．2 实验方法

2．2．1 DsALS基因的克隆

2．2．2 转化载体的构建

2．2．3 农杆菌介导的遗传转化

2．2．4 转化植株的分子水平检测

2．2．5 转化植株的抗性鉴定

3 结果和分析

3．1 DsALS基因的克隆

3．2 真核表达载体鉴定

3．2．1 pBI121-DsALS载体的验证

3．2．2 pCAMBIA3301-DsALS载体的验证

3．3 DsALS转化拟南芥和甘蓝型油菜

3．4 转化植株分子水平检测

3．4．1 PCR鉴定

3．4．2 RT-PCR鉴定

3．5 抗性鉴定

3．5．1 转基因拟南芥的抗性鉴定

3．5．2 转基因甘蓝型油菜的抗性鉴定

4 讨论

4．1 农杆菌介导的拟南芥转化和甘蓝型油菜转化

4．2 影响转化效率的因素

4．3 农杆菌介导获得转ALS油菜的意义

参考文献

致谢