团头鲂不同群体免疫相关指标的比较及部分基因的克隆

摘要

团头鲂（Megalobrama amblycephala）作为我国优良的大宗淡水养殖品种之一，其自然分布仅限于长江流域的鄱阳湖、淤泥湖和梁子湖等少数湖泊。近年来，由于长期人工繁育和数代的人工密集饲养，以及人为因素、洪涝等因素的影响，各天然水域团头鲂种群混杂繁殖，其遗传、生产性状及抗病力等方面，已产生一些退化迹象。本研究主要内容包括免疫相关基因的分子克隆及功能分析，同时比较了不同团头鲂地理种群间（鄱阳湖、淤泥湖和梁子湖）目的基因的组织表达和免疫相关指标，以此筛选出免疫性能较好的群体用于进一步育种。主要研究结果如下：
　　1.团头鲂目的基因的克隆及序列分析
　　本研究克隆得到了团头鲂CXCR4b和CCL4两个基因的cDNA全长序列。生物信息学分析显示：团头鲂CXCR4b的cDNA全长1638 bp，其中开放性阅读框有1062 bp，5’非翻译区有55 bp，3’非翻译区有521 bp，编码353个氨基酸。系统进化树分析发现团头鲂CXCR4b的氨基酸序列与鲤科鱼类具有较高的同源性，其中与草鱼同源性最高。团头鲂CXCR4b除了具有经典的七跨膜结构外，还具有某些保守的结构域：位于EC-1和EC-2的C107-C194构成的二硫键及其附近的Y188在各物种间均是完全保守的；通过比对还发现在靠近氮端的 IC-2区域有一个相对保守的DRYLAIV结构域。
　　研究结果表明：团头鲂CCL4的cDNA全长913 bp，其中开放性阅读框有285 bp，5’非翻译区有180 bp，3’非翻译区有448 bp，编码94个氨基酸。所预测的氨基酸序列经在线软件 ProtParam分析得知其分子量为10.43 kDa，等电点为9.24。团头鲂CCL4的氨基酸序列与所有CC亚族成员一样均有四个保守的半胱氨酸残基和保守的跨膜区域。系统进化树的分析结果表明团头鲂CCL4与硬骨鱼类的CCL4聚为一枝。
　　2.团头鲂目的基因的时间表达谱
　　荧光定量PCR的分析结果表明：所有检测的9个目的基因均在出膜前的表达量显著高于出膜后各时期（P<0.05），其表达峰值集中在10 hpf至28 hpf之间；出膜后各个时期的表达水平普遍偏低，但是在62 hpf时往往会出现第二个表达峰值。由此可知本研究所检测的9个目的基因与团头鲂的胚胎发育具有重要作用。
　　3.亚硝酸盐暴露对目的基因的作用
　　通过分析亚硝酸盐暴露后各个目的基因在六个主要免疫组织中的表达结果显示：当经过亚硝酸盐暴露后，目的基因均会被刺激而表达升高，且大多数在亚硝酸盐暴露24 h或48 h后达到最大值。由此可以推断出所有目的基因均与鱼类的非特异性免疫系统有关，且当受到外界刺激时会诱发炎症或者因炎症出现而激发其高表达。
　　4.团头鲂不同群体间免疫性能的初步评估与比较
　　通过分析目的基因在不同群体间的组织差异性表达可知，淤泥湖群体在所检测的组织中各目的基因的mRNA水平均显著高于其它两个群体（P<0.05），但梁子湖与鄱阳湖群体的表达差异并不显著；然后通过非特异性免疫指标和血液学指标的检测进一步评估三个群体的免疫性能，实验结果表明淤泥湖群体的 CAT、SOD和iNOS的活性普遍较低于其它两个群体，梁子湖群体在肝脏和脾脏中MDA的含量显著低于淤泥湖（P<0.05），与鄱阳湖群体的基本一致，而在头肾和肠中三个群体的MDA含量基本处于同一水平，不存在显著差异。分析结果表明血栓细胞在三个群体的白细胞所占比例大小依次：鄱阳湖>淤泥湖>梁子湖，梁子湖显著低于其它两个群体（P<0.05）；而淋巴细胞所占比例则呈现相反的趋势；此外还得知梁子湖群体的红细胞显著小于其它两个群体（P<0.05）。由此我们可以初步预测出淤泥湖群体的免疫性能最差，而梁子湖相对于鄱阳湖群体则表现出相对更好的免疫性能。

目录

声明

缩略语表

第一章 团头鲂及免疫相关基因简介

1 团头鲂研究现状简介

2 团头鲂免疫相关基因简介

2.1 趋化因子及受体家族基因

2.2 转铁蛋白及受体的简介

2.3 Toll样受体的简介

2.4 核受体家族及nr2f亚家族的简介

3选题的目的与意义

第二章 团头鲂免疫相关基因的克隆及功能研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 样本采集

2.2 提取RNA及目的基因的克隆

2.4 亚硝酸盐急性胁迫试验

2.5 荧光定量PCR

2.6 数据分析

3 结果与分析

3.1 目的基因的克隆与序列分析

3.2 目的基因的时间表达谱分析

3.3 亚硝酸盐暴露后目的基因的表达模式

4 讨论

4.1 目的基因的克隆及序列分析

4.2 目的基因时间表达谱与其功能的关系

4.3 目的基因的功能分析

第三章 团头鲂不同群体间免疫性能的初步评估与比较

1 前言

2 材料与方法

2.1 样品的采集

2.2 提取RNA及荧光定量PCR

2.3 非特异性免疫指标的检测

2.4 血涂片制作及分析

2.5 数据分析

3 结果与分析

3.1 目的基因的在不同群体的组织表达谱

3.2 非特异性免疫指标的结果分析

3.3 血液学指标的分析结果

4 讨论

4.1 团头鲂不同群体间免疫性能的初步评估

4.2 团头鲂不同群体间免疫性能的进一步评估

参考文献

附录

致谢