Cry1Ab/Cry1Ac对伞裙追寄蝇安全性评价及对粘虫的联合控制效果

摘要

目前转Bt（Bacillus thuringiensis）基因作物的大面积商业化种植，对非靶标害虫与天敌都造成潜在的风险。迄今为止，对转Bt基因作物或Bt蛋白-粘虫Mythimna separata（Walker）（鳞翅目：夜蛾科）-伞裙追寄蝇Exorista civilis（Rondani）（双翅目：寄蝇科）之间的关系研究较少。本文探究了Cry1Ab/Cry1Ac与伞裙追寄蝇对粘虫的联合控制作用，初步明确了亚致死浓度Cry1Ab与伞裙追寄蝇对粘虫免疫和飞行的影响，阐明了Cry1Ab杀虫蛋白对天敌伞裙追寄蝇的间接与直接影响。本研究进一步完善了室内Bt蛋白对粘虫与伞裙追寄蝇的安全性评价，为商业化大面积释放转基因作物的生态风险进行长期监测提供了科学依据，有助于充分发挥转基因技术在农业生产上的应用潜力。
　　室内测定了Cry1Ab/Cry1Ac与伞裙追寄蝇对六龄粘虫的控制效果，研究表明Bt蛋白与寄生蝇之间存在增效作用。设定CK（无Bt且不被寄生），0μg/g（无Bt但被寄生）处理，以及含有3.125μg/g、6.25μg/g、12.5μg/g、25μg/g浓度梯度杀虫蛋白的人工饲料饲喂六龄粘虫幼虫，置于6孔细胞培养板单头饲养，观察其幼虫生长发育状况。结果表明：在无Bt条件下，伞裙追寄蝇对六龄粘虫有显著的控制效果，0μg/g处理组死亡率显著高于CK组（P<0.05）。当饲喂被寄生的粘虫含有Bt的人工饲料后， Cry1Ab的3.125μg/g处理组表现出了与寄生蝇对粘虫的联合控制作用，其死亡率超过50％，显著高于0μg/g与CK组，6.25μg/g、12.5μg/g与25μg/g死亡率均为80%以上。Cry1Ac的联合控制作用则在12.5μg/g表现出来，该浓度下死亡率约为60%，而3.125μg/g与6.25μg/g处理组与0μg/g处理之间死亡率差异并不显著。Cry1Ab/Cry1Ac与伞裙追寄蝇共同作用，同样显著影响粘虫的生长发育，导致其化蛹率、羽化率随浓度增加而显著降低（P<0.05），蛹重显著减轻（P<0.05），但其蛹期差异不显著（P>0.05）。而且，对成虫的生殖也造成不利影响，显著延长其产卵前期（P<0.05），并使其产卵量显著减少（P<0.05）。综上所述，本实验证明在被寄生性天敌伞裙追寄蝇寄生并取食了Cry1Ab或Cry1Ac杀虫蛋白后，对六龄粘虫的控制效果非常显著，严重抑制了其生长发育和生殖。表明Bt与伞裙追寄蝇对粘虫种群动态有联合控制效果。
　　研究了亚致死浓度 Cry1Ab与伞裙追寄蝇对六龄粘虫体色与血细胞总数的影响，并观察了其生长发育，测定了其飞行潜力，初步探讨了粘虫对天敌的免疫与自身飞行之间的关系，表明该浓度Cry1Ab和寄生蝇影响降低粘虫免疫能力，但不会对影响其飞行潜力。本实验选择Cry1Ab蛋白的1.56μg/g浓度进行研究。设定6个处理，分别为粘虫取食正常玉米叶子（未被寄生/被寄生），取食正常人工饲料（未被寄生/被寄生），取食含Cry1Ab杀虫蛋白人工饲料（未被寄生/被寄生）。初步研究了该浓度的 Cry1Ab与伞裙追寄蝇对六龄粘虫体色及血细胞总数的影响。其中体色深浅通过光密度来判断，且二者存在正比关系。结果表明：处理48h后，六龄粘虫体色有较显著的差异（P<0.05），平均光密度和最大光密度都受到了影响，总体趋势为玉米叶处理组>正常人工饲料组>Cry1Ab组，且取食玉米叶子被寄生后平均光密度值显著小于取食玉米叶子未被寄生组，正常人工饲料和 Cry1Ab处理也表现出寄生后光密度值减小的趋势，但无显著差异（P>0.05）。由于粘虫幼虫体色由其血淋巴决定，所以其血细胞总数也表现出相似的结果。取食玉米叶且没有被寄生的粘虫幼虫血细胞总数最多；三种食物处理，均表现出被伞裙追寄蝇寄生后，血细胞总数减小的趋势。此外，还记录了粘虫幼虫死亡率、蛹重和羽化率等发育参数。结果表明：被寄生的比未被寄生粘虫幼虫生长发育好，但 Cry1Ab处理未被寄生与被寄生处理组粘虫死亡率差异不显著（P>0.05），说明伞裙追寄蝇对粘虫幼虫有一定的控制作用，1.56μg/g浓度的杀虫蛋白与伞裙追寄蝇对六龄粘虫的控制增效作用不明显。6个处理组羽化后的雌雄虫补充营养1d后，进行了14h的飞行潜力测试。结果表明：幼虫取食亚致死浓度 Cry1Ab并被伞裙追寄蝇寄生后，成功羽化的成虫的飞行时间、飞行距离和平均飞行速度并未呈现显著差异（P>0.05）。这说明亚致死浓度 Cry1Ab与伞裙追寄蝇不会影响粘虫成虫的飞行潜力。
　　研究了Cry1Ab杀虫蛋白通过寄主粘虫对伞裙追寄蝇产生的间接作用，探究了对伞裙追寄蝇寄生能力和生长生殖的影响，发现合适浓度的Bt对寄生蝇发育有促进作用，为全面评价转Bt基因作物的生态安全性提供了科学依据。伞裙追寄蝇对取食不同浓度 Cry1Ab杀虫蛋白（3.125μg/g、6.25μg/g、12.5μg/g、25μg/g饲料）48h后的粘虫寄生率和着卵量与CK处理没有显著的影响（P>0.05）；各处理之间伞裙追寄蝇的发育历期无明显差异（P>0.05），卵-幼虫期、蛹期和雌蝇产卵前期分别约为9d、13d和5d；各处理的寄蝇成虫羽化率及性比差异不显著（P>0.05），而且雌蝇的总产卵量也无显著差异（P>0.05）。但是，伞裙追寄蝇的出蝇蛹率和蛹重受到Cry1Ab杀虫蛋白的影响（P<0.05），其中取食含有3.125μg/g杀虫蛋白饲料的出蝇蛹率为33%， 为几个处理组中最高，显著高于CK的17%（P<0.05），而6.25μg/g、12.5μg/g、25μg/g处理组与对照差异不显著（P>0.05），分别为15%，15%和11%；蛹重随着Cry1Ab杀虫蛋白浓度的增加呈现下降的趋势，其中CK组蛹重最大，约为49.8mg。研究表明，实验所设浓度范围内的 Cry1Ab杀虫蛋白仅对伞裙追寄蝇蛹重造成不利影响，主要是由于其高浓度下寄主粘虫的生长状况受到严重影响；但其他发育参数显示无不利影响，甚至在3.125μg/g浓度下对伞裙追寄蝇的种群增长有促进作用。
　　测定了伞裙追寄蝇成虫取食Cry1Ab杀虫蛋白后的直接作用，室内测定结果表明寄生蝇直接取食Cry1Ab不会对其成虫寿命、生殖及F2代生长发育造成不利影响，进一步完善了Bt蛋白对伞裙追寄蝇的安全性评价。本实验设置了饥饿组（Starvation，简称S），清水组（Water solution，简称W）和含Cry1Ab杀虫蛋白的蜂蜜溶液处理组（3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml）以及无Bt的蜂蜜溶液组（Honey solution,简称H）。其中S处理组和W处理组伞裙追寄蝇成虫寿命显著短于其他处理组，雌雄蝇寿命约为5d（P＜0.05）。而H处理组以及Cry1Ab各处理组雌虫寿命和雄虫寿命均无显著性差异（P>0.05），每个处理组之间雌雄虫寿命也无显著性差异，但雄虫寿命略短（P>0.05）。虽然H处理组的雌蝇产卵前期为5.3d，略短于其他处理组的5.9d，5.7d，5.9d和5.9d，但无显著差异（P>0.05）。雌蝇一生产卵总量略低于H处理组，但各处理间并无显著性差异（P>0.05），分别为136粒，91粒，73粒，70粒，105粒。分别收集各处理组的一代伞裙追寄蝇雌虫寄生的粘虫幼虫，均饲喂正常人工饲料单头饲养。观察其F2代寄生蝇卵-幼虫期和蛹期，分别约为10d和13d左右，无显著差异（P>0.05）；对其 F2代蛹重、出蛹率和羽化率各处理间也没有显著差异（P>0.05）。说明Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇成虫寿命和雌虫生殖无不利影响，对其F2代生长发育也没有造成负面影响。

目录

声明

1 前言

1.1 转Bt基因作物的研究进展

1.2 转Bt基因作物对天敌昆虫的安全性评价

1.3 寄生蝇的研究进展

1.4 转Bt基因作物与天敌对寄主昆虫迁飞与免疫关系的研究进展

1.5 本课题研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验虫源

2.2 Cry1Ab/Ac杀虫蛋白与伞裙追寄蝇对粘虫的控制效果评价

2.3 亚致死浓度Cry1Ab与伞裙追寄蝇对粘虫的控制效果评价

2.4 Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇的间接影响

2.5 Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇的直接影响

2.6数据处理

3 结果与分析

3.1 Cry1Ab/Ac杀虫蛋白与伞裙追寄蝇对粘虫的控制效果评价

3.2 亚致死浓度Cry1Ab与伞裙追寄蝇对粘虫的控制效果评价

3.3 Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇间接作用

3.4 Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇直接作用

4 讨论

4.1 Cry1Ab/Ac杀虫蛋白与伞裙追寄蝇对粘虫的控制效果评价

4.2 亚致死浓度Cry1Ab与伞裙追寄蝇对粘虫的控制效果评价

4.3 Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇间接作用

4.4 Cry1Ab杀虫蛋白对伞裙追寄蝇直接作用

参考文献

附录

致谢