柠檬酸促进地衣芽胞杆菌WX-02合成聚-γ-谷氨酸机理的初探

摘要

聚γ-谷氨酸（γ-PGA）是一种天然的具有水溶性、生物降解性的生物高分子材料，可用作食品增稠剂、药物载体、化妆品保湿剂等。它无毒易吸收，具有广阔的商业前景和巨大的经济价值。在目前的聚γ-谷氨酸发酵生产过程中，向培养基中投入了大量的葡萄糖、谷氨酸，但是据之前的研究来看，γ-PGA的主要前体来自于外源添加的谷氨酸，葡萄糖并未转化为成目的产物；另一方面，发酵后期培养液中依然残留大量未被利用的谷氨酸，造成原料的大量浪费。所以，提高葡萄糖向γ-PGA的转化率，减少溢流代谢产物的积累，提高原料中谷氨酸的利用率是亟待解决的问题。
　　本课题研究了Bacillus licheniformis WX-02在仅以70 g/L葡萄糖，8 g/L氯化铵为碳、氮源的培养基中生长情况。发现在该培养基中添加足量的pH缓冲剂后， B.licheniformis WX-02能正常生长，且合成乙偶姻，培养24 h后乙偶姻产量达到20.2 g/L，但无γ-PGA合成。
　　向培养基中添加10 g/L的TCA循环中的柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、和苹果酸后，该菌都能够合成γ-PGA，尤其是添加柠檬酸后，其γ-PGA合成量最高达到7.5g/L。向培养基中添加0.5g/L的EDTA-2Na，经优化培养基中硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、氯化钙添加量后，γ-PGA产量达到10.0 g/L比优化前提高34.1%。经液相色谱和气象色谱法检测后，发现发酵过程中积累乙酸和乙偶姻（2,3-丁二醇）两种主要的溢流代谢产物，其产量分别达到6.9 g/L和13.4 g/L。增加培养基中柠檬酸钠的投入量后γ-PGA的产量得到提升，但柠檬酸钠利用率降低，而且乙酸和乙偶姻（2,3-丁二醇）的积累并未得到有效的抑制。
　　鉴于以上发现，本实验室构建了一系列2,3-丁二醇合成途径缺失的基因工程菌。经发酵对比后，发现B.licheniformis WX-02中alsS基因和ilvB基因都参与乙酰乳酸的合成。当乙酰乳酸的合成被部分阻断后，乙酸的积累量比对照增加近100%，生物量和γ-PGA合成量降低。当乙酰乳酸的合成途径完全阻断后，严重影响菌的生长，对γ-PGA合成不利。由此推测，要达到减少溢流代谢产物积累提高γ-PGA的合成的目的，需要在阻断乙酸合成的基础上，强化丙酮酸进入TCA循环的路径，加强表达丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或许是可行的方法。

目录

声明

第一章 前言

1.1聚-γ-谷氨酸的性质及应用

1.2合成聚-γ-谷氨酸的微生物

1.3微生物合成聚-γ-谷氨酸的营养需求

1.4枯草芽孢杆菌的中心碳代谢

1.5柠檬酸性质及其在发酵上的应用

1.6目的及意义

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4小结

第三章 2,3-丁二醇合成途径缺失对地衣芽孢杆菌WX-02发酵的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与讨论

3.4小结

第四章 讨论与展望

4.1讨论

4.2展望

参考文献

附录：

致谢