南大西洋深海长链烷烃降解菌多样性分析及咸水球形菌属比较基因组学初步研究

摘要

本文对南大西洋5个不同站点的深海沉积物样品开展长链烷烃(正三十二烷C32)降解菌富集分离及多样性分析。共分离到了25株细菌，分属于14个属19个种，且包含2株新种。在这25株细菌中，Alcanivorax、Erythrobacter、Pseudoalteromonas和Pseudomonas属的细菌分别占到了总数的16％、16％、12％和12％，为可培养细菌当中的主要优势菌株。长链烷烃烷烃降解实验表明，Paracoccus和Alcanivorax属的2株菌（32C-B6和32C-C3）对长链烷烃的降解能力最好。构建的16S rDNA和alkB基因克隆文库表明在5个长链烷烃降解菌群均以γ-Proteobacteria纲的细菌为主要优势菌群。在属的水平上，虽然不同菌群的结构有差异，但均含有Marinobacter或者Alcanivorax属细菌，且在烷烃降解过程起着重要的作用。
　　 另外，本研究还对10株咸水球形菌属的细菌开展了比较基因组学的初步分析，基因组大小范围为3.75 Mb～4.37 Mb，G+C含量和编码基因数目范围分别为61.39％～64.13％和3366～4140之间。平均核苷酸相似度ANIm值和核心基因当中的单拷贝基因构建系统进化树结果可以看出菌株Salinisphaera sp.C84B14、Salinisphaera sp.S4-8和Salinisphaera sp.T31B1是潜在的三个新种。泛基因组分析结果表明10株共包含8733个泛基因，其中核心基因为1759个，约占泛基因组总数的20.14％，其中代谢相关的基因占了主要部分。非必需基因组(Dispensable genome)包含6974个基因，其中各个菌株特有的基因总数为3113，占泛基因组数目的35.65％，平均每个菌株含有311个特有基因。另外，还对10株咸水球形菌的烷烃降解相关基因进行了分析，发现每株菌均含有1～2个alkB基因，这些alkB基因的编码蛋白含有四个保守区，同时在其上下游区域包含烷烃降解途径中的一系列重要酶类。对菌株Salinisphaera sp.C84B14的烷烃降解相关基因进行实时荧光定量PCR分析，发现其alkB基因在以不同链长烷烃为唯一碳源生长的条件下均上调表达，可以推测该alkB基因确实是一个具有烷烃降解功能的烷烃羟化酶基因。
　　 综上，本文主要通过16S rDNA文库和alkB基因文库研究了南大西洋5个不同站点深海沉积物样品富集菌群多样性的组成，并分离到了一些潜在的长链烷烃降解菌，初步认识了深海环境中长链烷烃降解的菌群组成情况。并通过比较基因组学初步研究了咸水球形菌的系统进化关系和泛基因组，核心基因组的基本特征。同时还针对烷烃降解相关的羟化酶基因alkB进行了研究，对咸水球形菌利用烷烃的分子生物学基础有了一定的认识。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 海洋石油污染现状及其危害

1．2 石油的组成

1．3 生物修复在海洋石油污染中的应用

1．4 海洋环境石油烃降解微生物多样性研究进展

1．5 烷烃降解机制研究进展

1．5．1 烷烃羟化酶AlkB研究进展

1．5．2 细胞色素P450羟化酶研究进展

1．5．3 长链烷烃羟化酶研究进展

1．6 微生物比较基因组学研究现状和进展

1．6．1 微生物基因组学研究进展

1．6．2 微生物比较基因组学研究

1．7 咸水球形菌属研究进展

1．8 本文研究目的及意义

2 实验材料方法

2．1实验材料

2．1．1 试剂和药品

2．1．2 分子生物学常用酶和试剂盒

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 培养基配制

2．1．5 实验引物

2．1．6 常用分析软件

2．1．7 常用网址

2．1．8 正三十二烷富集深海样品来源

2．1．9 咸水球形菌属10株菌具体信息

2．2 DNA遗传操作

2．2．1 核酸DNA提取

2．2．2 PCR扩增产物的纯化

2．2．3 连接

2．2．4 大肠杆菌感受态制备

2．2．5 外源DNA的转化

2．2．6 转化子的筛选鉴定

2．2．7 大肠杆菌质粒的提取

2．3 烷烃富集菌群多样性分析

2．3．1 长链烷烃降解菌的富集分离和纯培养菌株的获得

2．3．2 长链烷烃降解菌烃降解能力定性分析

2．3．3 降解菌群总DNA提取

2．3．4 16S rDNA和alkB克隆文库构建

2．3．5 16S rDNA克隆文库分析

2．3．6 alkB克隆文库分析

2．4 咸水球形菌总RNA遗传操作

2．4．1 菌株的诱导培养条件

2．4．2 总RNA提取

2．4．3 总RNA的纯化

2．4．4 反转录

2．4．5 实时定量PCR(real-time quantitative PCR)

2．5 咸水球形菌属10株菌比较基因组学分析

2．5．1 咸水球形菌属基因组测序

2．5．2 系统进化分析

2．5．3 泛基因组与核心基因组分析

2．5．4 非编码RNA(non-codon RNA)，基因岛(Genomic Island)和前噬菌体(Prophage)，转座元件和CRISPR(间区规律聚积的短回文重复)分析

3 实验结果分析与讨论

3．1 烷烃富集菌群多样性分析

3．1．1 可培养菌株单克隆的分离

3．1．2 可培养菌株烃降解能力定性分析

3．1．3 不同站位16S rDNA克隆文库分析

3．1．4 不同站位16S rDNA克隆文库微生物的群落结构

3．1．5 不同站位16S rDNA克隆文库和分离菌株的综合分析

3．1．6 不同站位16S rDNA克隆文库α-多样性分析

3．1．7 不同站位alkB克隆文库分析

3．1．8 不同站位口凇克隆文库α-多样性分析

3．1．9 讨论

3．2 咸水球形菌比较基因组学分析

3．2．1 基因组测序结果

3．2．2 ANI分析

3．2．3 系统进化树分析

3．2．4 泛基因组和核心基因组分析

3．2．5 基因岛，前噬菌体，转座元件和CRISPR预测分析

3．2．6 咸水球形菌alkB基因簇分析

3．2．7 Salinisphaera sp．C84B14在不同烷烃诱导下alkB基因表达的实时定量PCR分析

3．2．8 Salinisphaera sp．C84B14中其他单加氧酶基因的实时定量PCR分析

3．2．9 结果讨论

4 小结与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间已发表论文

致谢