利用柑橘愈伤组织研究植物类胡萝卜素积累的调控机理

摘要

类胡萝卜素是自然界中常见的物质，是植物生存必需的次生代谢物。它参与众多生物学过程，对人类健康及动植物生存具有重要意义，它赋予花卉果实丰富色彩，有利于授粉和种子传播。因此，深入理解植物中类胡萝卜素的代谢调控机制有助于我们更好地利用类胡萝卜素，使其服务于我们的生活。
　　柑橘愈伤组织本身含有多种类胡萝卜素，又因其生长周期短、培养条件简易可控等特点，使之成为植物类胡萝卜素代谢研究的较理想材料。本研究通过多种外界因素处理柑橘愈伤组织，包括光暗、除草剂、生长周期、糖分和激素处理，深入分析了不同因素对柑橘愈伤组织中类胡萝卜素代谢调控特征及类胡萝卜素代谢同其它生物学过程的关系。主要研究结果如下:
　　1、对红马叙葡萄柚(Red Marsh grapefruit)（Citrus paradisi Macf.）、默科特橘橙(Murcott tangor)（C.reticulata×C sinenis、塔罗科血橙（Tarocco blood orange）(C.sinensis[L.]Osbeck)和冰糖橙甜橙(Bingtangchengsweetorange)(Csinensis[L.]Osbeck)4种柑橘胚性愈伤组织进行光照/黑暗处理。HPLC和Real-TimePCR分析表明，光照对柑橘愈伤组织中类胡萝卜素的调控模式因受基因型影响呈现多样性。在光照条件下，红马叙葡萄柚愈伤组织中类胡萝卜素的合成受阻;而塔罗科血橙愈伤组织中类胡萝卜素受光照诱导积累。环氧类胡萝卜素的光稳定性强于非环氧类胡萝卜素，如花药黄质和紫黄质。同时本实验发现PSY是2种甜橙愈伤组织中类胡萝卜素合的限速基因;而在默科特橘橙愈伤组织中，光照强烈诱导CRTISO的表达。
　　2、CPTA是胡萝卜素环化酶抑制剂，用0.2％(w/v)浓度处理红马叙愈伤组织，结果表明CPTA不仅能有效地促进类胡萝卜素（特别是番茄红素）的合成积累，还能刺激一些次生代谢物的合成，例如类黄酮和生物碱类物质，但对初生代谢物的生物合成影响不大。利用基因芯片分析处理前后愈伤组织中转录水平上的差异，其中33个基因上调，90个基因下调。这些基因包括编码过氧化物酶、抗逆相关基因和P450等。同时，检测到过氧化氢(H2O2)、JA、SA和ABA含量下降。本研究认为，红马叙愈伤组织在CPTA的刺激下产生大量抗氧化性物质（特别是类胡萝卜素和类黄酮）并可能通过非酶促反应缓解了细胞内的氧化胁迫，避免了激活由激素介导的抗逆机制。同时，本研究发现CPTA处理后IAA的增加可能是引起类胡萝卜素总量激增的部分原因。
　　3、利用基因芯片对自然生长状态下(10DAC和30DAC)的愈伤组织进行分析。结果表明，共有2505个差异表达基因，其中上调1154个，下调1351个，并利用Real-TimePCR的方法对基因芯片结果进行验证。初生代谢组分析表明大部分可溶性糖和有机酸的含量显著下降，而氨基酸和脂类含量变化不大，这暗示愈伤组织在生长后期缺乏碳水化合物提供能量。结合芯片数据分析发现，糖分的匮乏可能引起TCA循环的加速以弥补能量供给不足，同时可能与抗氰呼吸清除细胞内自由基有关;而碳链在逆境环境下有向次生代谢物流动的趋势。在生长后期，伴随类胡萝卜素含量急剧的减少，类胡萝卜素合成相关基因显著上调，说明类胡萝卜素含量的降低可能是多因素导致。H2O2含量的增加也表明愈伤组织受到氧化胁迫。本研究认为，生长后期糖匮乏可能引起了愈伤组织中H2O2含量的增加，而H2O2对类胡萝卜素的积累有一定影响，同时糖分和激素对类胡萝卜素合成的调控有待深入研究。
　　4、在培养基中添加不同浓度蔗糖或葡萄糖，以研究糖分对类胡萝卜素调控的作用。结果表明，外源糖分能刺激愈伤组织中类胡萝卜素的合成，但在较高糖分浓度下，类胡萝卜素的合成受到抑制。Real-TimePCR分析表明外源糖分并不能诱导类胡萝卜素合成相关基因表达，60mM葡萄糖甚至会抑制类胡萝卜素合成相关基因表达。但外源糖分能明显诱导糖转运及糖信号基因的表达，如SUT,TMT和HXK，说明糖可能是愈伤组织中类胡萝卜素合成的信号因子。
　　5、使用外源植物激素ABA、IAA、GA和JA分别处理红马叙愈伤组织12h，3d和10d。结果发现，处理3d和10d后类胡萝卜素积累普遍显著性升高，其中以IAA的效果最为显著。随着处理时间的延长，激素对类胡萝卜素的刺激作用略有降低，但仍高于对照。Real-TimePCR分析结果表明，不同激素对类胡萝卜素转录调控模式存在差异。而对激素相关基因的表达分析发现，属于MADS-box转录因子家族的基因AGL6可能与类胡萝卜素合成有关。
　　综上所述，本研究对理解植物类胡萝卜素代谢的生物学本质具有重要价值，对类胡萝卜素调控进行了进一步的探索，为揭示类胡萝卜素调控机理提供了新的和重要的线索。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 类胡萝卜素的合成与调控研究进展

1 课题的提出

2 植物类胡萝卜素的相关研究进展

2．1 类胡萝卜素生理功能

2．2 植物类胡萝卜素代谢途径

2．3 植物类胡萝卜素的合成与调控

2．4 类胡萝卜素与激素代谢的相关性研究

3 表达谱和代谢组技术的发展及利用

3．1 表达谱芯片技术的发展

3．2 表达谱芯片技术在植物研究中的应用

3．3 代谢组技术的发展

3．4 代谢组技术在植物研究中的应用

4 愈伤组织的保存及利用

第二章 光暗处理调控不同品种柑橘愈伤组织中类胡萝卜素积累的研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 四种愈伤组织在不同光照条件下类胡萝卜素含量的变化

3．2 Real-Time PCR分析类胡萝卜素相关基因表达变化

4 讨论

4．1 不同基因型愈伤组织对光照敏感度不同

4．2 光照对柑橘愈伤组织中PSY表达量的影响

4．3 光照对红马叙葡萄柚愈伤组织中PDS表达量的影响

4．4 光照对柑橘愈伤组织中其他类胡萝卜素合成相关基因的影响

5 小结和展望

第三章 CPTA调控红马叙愈伤组织中类胡萝卜素积累的研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 CPTA处理后愈伤组织中表达谱差异基因统计

3．2 差异基因功能注释和分类

3．3 CPTA处理后愈伤组织中类胡萝卜素含量及相关合成基因表达量的变化

3．4 CPTA处理后愈伤组织中激素和H2O2含量的变化

3．5 CPTA处理后愈伤组织中代谢物含量的变化

4 讨论

4．1 CPTA处理后愈伤组织中总类胡萝卜素上升

4．2 CPTA处理后逆境相关激素和H2O2的含量降低

4．3 CPTA处理提高愈伤组织中次生代谢物

4．4 CPTA处理对愈伤组织中初生代谢物的影响

4．5 小结与展望

第四章 不同生长周期调控红马叙愈伤组织中类胡萝卜素积累的研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 不同生长周期表达谱差异对比分析

3．2 Real-Time PCR验证基因表达

3．3 差异基因功能注释和分类

3．4 不同生长周期愈伤组织中初生代谢物的变化

3．5 不同生长周期愈伤组织中类胡萝卜素及H2O2含量的变化

4 讨论

4．1 愈伤组织在生长后期呈现衰老趋势

4．2 糖源匮乏引起碳源流向重新分配

4．3 衰老愈伤组织中转录因子的改变

4．4 糖源匮乏引起TCA循环加速

4．5 H2O2含量在衰老愈伤组织中升高

5 小结与下一步设想

第五章 糖分调控红马叙愈伤组织类中胡萝卜素积累的研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 不同蔗糖、葡萄糖浓度处理对愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响

3．2 不同蔗糖、葡萄糖浓度处理对愈伤组织中类胡萝卜素合成相关基因表达量的影响

4 讨论

4．1 最适于愈伤组织积累类胡萝卜素的糖分浓度有别于其他植物组织

4．2 糖分可能是愈伤积累类胡萝卜素的信号因子

5 小结及后续试验设想

第六章 激素调控红马叙愈伤组织中类胡萝卜素积累的研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 不同激素处理对愈伤组织类胡萝卜素含量的影响

3．2 不同激素处理对愈伤组织中类胡萝卜素合成相关基因表达的影响

4 讨论

4．1 植物激素促进愈伤组织中类胡萝卜素的积累

4．2 激素相关基因可能是调控类胡萝卜素的关键

5 小结及后续试验设想

总讨论及未来展望

附录攻读博士期间发表的论文

参考文献

附表

附表Ⅰ

附表Ⅱ

致谢