水稻及其重要病原真菌BAC相关资源的构建和分析

摘要

水稻是重要的粮食作物，为全世界超过50％的人口提供营养，也是禾本科研究的模式生物。绿色革命和杂交水稻使得水稻产量在1960年之后翻了一倍，但是传统育种手段很难再使水稻产量大幅飞跃。伴随着全球人口的快速增长和农作物病虫害的日益严重，我们面临着越来越严峻的粮食短缺问题。水稻及其真菌性病原菌大片段基因组文库和物理图谱在其基因组比较分析、基因组序列拼接和图位克隆等研究中具有重要价值，对提高水稻产量和控制水稻病害有着重要的意义。
　　籼稻品种明恢63和珍汕97是我国种植面积最大的杂交水稻汕优63的父母本，蕴藏着众多优良性状相关基因，基于它们所构建的重组自交系群体在产量相关QTL的鉴定和分析中发挥了重要作用。我们构建了具有基因组10倍覆盖度的明恢63和珍汕97的BAC文库，对每个文库中一半的克隆进行了双末端测序和指纹图谱分析，并构建基于BAC的物理图谱。然后以克隆重叠群中的末端序列作为桥梁，将明恢63和珍汕97的物理图谱比对到粳稻日本晴和籼稻93-11的全基因组序列上，分别构建了栽培稻亚种间和亚种内的比较物理图谱，并依此鉴定了基因组之间大量的扩增、收缩和颠倒等染色体重排区域。在日本晴的扩增区域内，重复序列和与抗性相关的基因数量都高于全基因的平均值。将过滤掉重复序列后的末端序列比对到参考序列的同源区域，鉴定了大量的SNP，MNP，Insertion，Deletion和具有多态性的SSR标记。以来自OMAP(OryzaMapAlignmentProject)的Oryzaglaberrima，Oryzanivara和2个Oryzarufipogon作为对照材料，分析了我们所鉴定的结构变异在所有分析品种中的分布，并推断这些变异的来源以及在水稻进化和驯化过程中基因组的保守和易变区域。最后将实验室所有的水稻物理图谱（明恢63、珍汕97、93-11和中华11）、具有双末端序列的克隆、来自GRAMENE的水稻分子标记和QTL信息、具有多态性的SSR标记、日本晴的注释信息以及我们鉴定的所有结构变异整合在一起，并且对齐到日本晴的参考序列上(http://Gresource.hzau.edu.cn)。这些资源为水稻的比较基因组学和功能基因组学研究提供了良好的材料和基础。
　　水稻稻曲病是由稻曲病菌（Villosiclavavirens）引起的，它已经从水稻的次生病害上升为水稻的主要病害，在大部分的水稻主产区均有发生。目前，关于稻曲病菌的基因组和致病机制的研究基本上还是一片空白，我们构建了稻曲病菌UV-8b的BAC文库，对可以覆盖基因组10倍的克隆进行了双末端测序和指纹分析，并构建了稻曲病菌的第一个物理图谱。通过末端序列获得了对稻曲病菌基因组的初步认识，例如51.52％的GC含量、22.52％的重复序列、376.12/Mb的SSR密度和大约36.01％的基因编码序列。通过序列比较分析发现，稻曲病菌的基因组与绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）、木霉（Trichodermareesei)、赤壳属（Nectriahaematococca）和虫草属（Cordycepsmilitaris）亲缘关系较近。这是第一套稻曲病菌基因组资源，为稻曲病菌的遗传学、基因组学和分子生物学研究提供了资源和基础。
　　稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）所引起的水稻稻瘟病，是水稻最为严重的病害。病原菌基因组的多样性和易变性是稻瘟病防治中的难题。先前的研究者已经对分离自日本的P131菌株进行了全基因组测序，但是序列的连续性不高（1823个序列scaffold,N50和最长的序列长度分别为65Kb和459Kb）。为了提高P131菌株的序列拼接质量，我们用HindIII和BamHI分别构建了P131菌株的BAC文库，对每个文库中可以覆盖基因组5倍的克隆进行了双末端测序和指纹分析，并构建了物理图谱。加入双末端序列信息之后，N50和最长的序列长度分别提高到了147.28Kb和1848.42Kb。可以预见加入物理图谱信息后，序列拼接的质量还将大幅提高。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 基因组文库

1．1．1 基因组文库的发展

1．1．2 BAC文库的应用

1．2 物理图谱

1．2．1 物理图谱的构建

1．2．2 物理图谱的编辑

1．2．3 物理图谱的应用

2 明恢63和珍汕97物理图谱的构建和比较分析

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 BAC文库构建，末端测序和指纹分析

2．2．2 物理图谱的组装

2．2．3 末端序列中细胞器DNA分析

2．2．3 末端序列中简单重复序列(SSR)分析

2．2．4 末端序列中重复序列分析

2．2．5 末端序列中替换、插入和缺失的检测

2．2．6 BAC-size结构变异的检测

2．2．7 比较物理图谱的构建和分析

2．2．8 资源的整合及利用

2．3 结果与分析

2．3．1 BAC文库构建，末端测序和指纹图谱

2．3．2 物理图谱组装

2．3．3 细胞器DNA分析

2．3．4 末端序列中的SSR分析

2．3．5 重复序列分析

2．3．6 替换、插入和缺失的检测

2．3．7 BAC-size结构变异检测

2．3．8 物理图谱的比较分析

2．3．9 禾本科内部共线性分析

2．3．10 物理图谱资源的整合及展示

2．4 讨论

2．4．1 MH63和ZS97与参考序列间的比较物理图谱

2．4．2 基因组序列间的差异

2．4．3 资源的整合和利用

3 稻曲病菌基因组资源的构建及分析

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 BAC质粒抽提和末端测序

3．2．2 指纹分析、物理图谱组装和验证

3．2．3．末端序列中重复序列和SSR分析

3．2．4 末端序列的基因注释

3．2．5 比较分析

3．3 结果与分析

3．3．1 BAC末端测序

3．3．2 指纹分析和物理图谱的组装

3．3．3 物理图谱质量检测

3．3．4 末端序列中重复序列分析

3．3．4 末端序列中简单重复序列(SSR)分析

3．3．5 基因注释

3．3．6 比较基因组分析

3．4 讨论

4 稻瘟病菌BAC文库和物理图谱的构建

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 高分子量基因组DNA的制备

4．2．2 部分酶切和大片段DNA的第一次筛选

4．2．3 大片段DNA的第二次筛选和洗脱回收

4．2．4 克隆载体的制备

4．2．5 BAC文库构建和插入片段检测

4．2．6 末端测序、指纹分析和物理图谱组装

4．2．7 全基因组序列的重新组装

4．3 结果与分析

4．3．1 BAC文库构建

4．3．2 BAC末端测序和物理图谱

4．3．3 稻瘟病菌序列的重新组装

4．4 讨论

参考文献

附录

致谢