淡水养殖池塘环境中氨氧化微生物的研究

摘要

高密度集约化池塘养殖过程中产生的环境污染逐渐地引起人们的关注。大量饲料氮素残留在池塘水体和沉积物中。在这些残留氮素的生物地球化学循环过程中，氨氧化作用是硝化反应的第一步，也是限速步骤，决定了氮素循环过程的快慢。本课题以氨氧化微生物为主要研究对象，调查了四大家鱼养殖池塘中氨氧化微生物的时空分布规律，研究了空心菜浮床根系氨氧化微生物及其对净化养殖池塘水质的作用，探索了一种基于富集氨氧化微生物的生物悬浮载体池塘水质改良技术，主要研究结果如下:
　　1)开发了一种新的沉积物微生物总DNA提取方法，琼脂糖凝胶电泳结果表明，通过此方法所获得的DNA条带整齐，大小在23kb左右。以AOAamoA基因为目的基因，通过qPCR方法对此方法进行了验证，结果表明通过本提取方法所得DNA，无论在得率还是在纯度方面均能达到土壤微生物总DNA提取试剂盒水平。
　　2)对湖北省公安县的10口四大家鱼养殖池塘氨氧化微生物时空分布规律进行了周年调查。结果表明养殖水体中氨氧化微生物以AOB为主;AOAamoA基因在检测限以下，可能受到光抑制;未检测到Anammox菌的存在。夏季水体AOBamoA基因浓度显著高于其它季节;其它3个季节，水体中的AOBamoA基因浓度无显著差异。在沉积物中同时存在AOA、AOB和Anammox菌3种氨氧化微生物，并且都表现出季节变化规律。AOA浓度比AOB约高一个数量级，AOB最大浓度出现在秋季和冬季，AOA则出现在冬季。AOB和AOA最低浓度都出现在夏季。Anammox菌最高浓度出现在夏季和秋季，最低浓度则出现在冬季。综合分析推测DO是调控沉积物中3种氨氧化微生物的主要生态因子。
　　统计分析表明，夏季沉积物中AOAamoA和Anammox菌16SrRNA基因以及AOBamoA和Anammox菌16SrRNA基因之间都存在显著性正相关关系(r=0.511，p＜0.01;r=0.448，p＜0.05;NonparametricCorrelations)，表明夏季池塘沉积物中AOA和Anammox菌以及AOB和Anammox菌之间可能都存在一定的协同作用。Anammox菌16SrRNA基因浓度在夏季最高，并且和沉积物间隙水硝氮浓度之间存在显著性正相关关系(r=0.520，p＜0.01;NonparametricCorrelations)，表明夏季池塘沉积物中Anammox对氮素循环可能发挥着重要作用，硝氮是影响Anammox菌浓度的重要生态因子。秋季沉积物中AOBamoA基因浓度最高，并且和间隙水亚硝氮浓度之间存在显著性正相关关系(r=0.705，p＜0.01;NonparametricCorrelations)，表明秋季池塘沉积物中AOB对于氨氮的氧化可能起主要作用。统计分析表明冬季池塘沉积物中AOAamoA基因和Anammox菌16SrRNA基因之间存在显著性的正相关关系(r=0.794，p＜0.01;NonparametricCorrelations)，表明冬季池塘沉积物氮素循环过程中AOA和Anammox菌之间可能存在协同作用。
　　3)在面积为7000m2的养殖池塘中进行了空心菜浮床净化水质实验，并研究了水体及根系氨氧化微生物的浓度及多样性。覆盖面积7.5％的空心菜浮床能够有效降低水体总氨氮浓度;同时，空心菜浮床通过调节水体pH，能够有效降低水体分子氨浓度:在晴好天气，浮床池塘分子氨浓度显著低于对照塘。空心菜根系上附着的AOBamoA基因浓度达105copy/g-106copy/g，比空心菜根系上的AOAamoA基因浓度高一个数量级左右。此外，结果显示空心菜根系上的AOB全部归属于Nitrosomonaseuropealineage类群，水体和沉积物中的AOB虽然也以Nitrosomonaseuropealineage类群为主，但还有32.43％的水体AOB和38.46％的沉积物AOB归属在另外两个类群:Nitrosospiraultiformislineage和Nitrosomonasoligotrophalineage中。空心菜根系上的AOA全部归属在Group1.1b类群中，而沉积物中80％的AOA分布在Group1.1b类群中，另外20％的AOA则属于Group1.1a类群。
　　4)研究了悬挂在池塘水体中生物悬浮载体上氨氧化微生物的富集生长状况，并对富集后的载体进行了水质净化效果研究。本研究中选择水族箱中经常用的过滤棉(PFC)作为悬浮载体，悬挂在池塘水体不同水层中，结果显示15d左右PFC上的AOBamoA基因就可达到107copy/cm3水平，然而，养殖水体AOBamoA基因浓度一直保持在101copy/cm3-102copy/cm3。室内实验研究表明，富集饱和AOB后的PFC具有较高的氨氮氧化活性，当pH、温度和DO分别为7.0-8.5、28℃和6.0mg/L-7mg/L时，氨氮转化速率达0.035±0.002mg(N)cm-3(PFC)h-1。氨氮转化速率随pH(6.0-6.5;7.0-8.5;9.5-10.0)的升高而升高;氨氮转化速率和温度(14℃，21℃，28℃，35℃)之间具有极显著的正相关关系;DO(1.0mg/L-2.0mg/L;6.0mg/L-7.0mg/L)水平对氨氮转化速率没有显著性影响。PFC作为生物悬浮载体在池塘水质修复方面拥有良好的应用前景。

目录

声明

摘要

符号及缩略语表

第1章 文献综述

1．1 AOA研究进展

1．1．1 AOA的发现

1．1．2 AOA和与环境因子的关系

1．2 Anammox菌研究进展

1．2．1 Anammox的发现

1．2．2 已鉴定的Anammox菌

1．2．3 Anammox菌的分布、生态多样性

1．2．4 Anammox菌的研究方法

1．3 研究目的和意义

第2章 沉积物微生物总DNA提取方法的研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 淡水沉积物微生物总DNA提取

2．2．2 DNA得率和片段大小

2．2．3 qPOR定量分析AOA amoA基因

2．2．4 质粒构建

2．3 结果与分析

2．3．1 DNA得率和质量

2．3．2 qPGR定量分析AOA amoA基因

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 在池塘水体和表层沉积物中氨氧化微生物的分布和季节变化规律

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 池塘样品采集

3．2．2 池塘水体理化指标测定

3．2．3 水样和沉积物微生物总DNA提取

3．2．4 质粒构建

3．2．5 池塘水样和沉积物氨氧化微生物定量分析

3．3 结果与分析

3．3．1 养殖池塘水体中氨氧化微生物的组成和季节变化

3．3．2 养殖池塘沉积物中氨氧化微生物的组成和季节变化

3．4 讨论

3．4．1 养殖池塘水体中氨氧化微生物的组成和季节变化

3．4．2 养殖池塘沉积物中氨氧化微生物的组成和季节变化

3．5 小结

第4章 空心菜浮床降低养殖池塘水体氨氮机理初步研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 淡水养殖池塘和空心菜浮床

4．2．2 样品收集和理化指标测定

4．2．3 池塘水体和空心菜根系微生物总DNA的提取

4．2．4 AOA和AOB amoA基因多样性和系统发育分析

4．2．5 池塘水体和空心菜根系AOA和AOB定量分析

4．2．6 空心菜根系AOA和AOB amoA基因总数量的评估

4．3 结果与分析

4．3．1 空心菜浮床和根系

4．3．2 养殖池塘水体理化因子

4．3．3 AOA和AOB amoA基因多样性和系统发育分析

4．3．4 空心菜浮床根系和水体AOA和AOB amoA基因数量

4．4 讨论

4．4．1 养殖池塘环境中的amoA基因多样性和数量

4．4．2 空心菜浮床对水体氨氮的去除效果

4．5 小结

第5章 利用生物悬浮载体原位富集氨氧化微生物及其降低氨氮效果研究

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 氨氧化微生物的富集和样品采集

5．2．2 理化指标的测定和微生物总DNA提取

5．2．3 池塘水样和PFC上氨氧化微生物数量的检测

5．2．4 PFC氨氮转化能力的检测

5．2．5 不同温度、pH、DO条件下氨氮转化速率的测定

5．2．6 氨氮转化速率的计算

5．3 结果与分析

5．3．1 氨氧化微生物浓度的变化

5．3．2 PFC氨氮转化能力的检测

5．3．3 不同温度、pH、DO对氨氮转化速率的影响

5．4 讨论

5．4．1 氨氧化微生物浓度的变化

5．4．2 氨氮转化速率

5．5 小结

第6章 总结

参考文献

附录

致谢