离体条件下铜对草鱼和黄颡鱼肝细胞脂代谢影响的研究

摘要

铜作为一种常见的重金属，同时又是鱼类生长的必需元素，它对鱼类的影响已经引起了广泛的关注。以往的研究主要集中在氧化应激、蓄积作用和组织学变化等方面，而关于铜对脂代谢的影响，尤其是采用离体细胞作为实验模型的研究还未见报道。本文以草鱼肝细胞系为研究对象，研究了铜对草鱼肝细胞脂代谢的影响以及硒的保护作用，同时以黄颡鱼为研究对象，建立了黄颡鱼离体肝细胞模型，研究了铜对黄颡鱼离体肝细胞脂代谢的影响以及可能存在的通路。主要研究结果如下:
　　1.以草鱼肝细胞系为模型，选取3个铜浓度(0、10μM、100μM)和3个孵育时间(24h、48h、96h)来研究离体条件下铜对草鱼肝细胞脂代谢的影响。研究结果表明，离体条件下铜对草鱼肝细胞脂代谢的影响呈现剂量和时间依赖关系:孵育24h时，铜降低了几种脂肪合成和脂肪分解相关的基因表达水平;孵育48h时，铜抑制了脂肪合成的过程，但上调了脂肪分解;孵育96h时，与对照组相比，铜继续上调脂肪分解作用，对脂肪合成作用没有显著影响，但引起脂肪消耗。尽管孵育96h脂肪合成作用有可能被上调，但这不足以补偿脂肪的消耗。本文首次研究了离体条件下铜对鱼类肝细胞脂代谢的剂量和时间依赖关系，为研究铜对鱼类酶学和分子水平的毒性提供了新的思路。
　　2.以草鱼肝细胞系为模型，评价了离体条件下，两种浓度硒（5μM和10μM）的添加是否具有阻止铜诱导的草鱼肝细胞脂代谢改变的能力。结果显示:在3个铜添加组(100μM)中，孵育24h时随着硒浓度的增加，脂肪合成相关酶活性升高，而分解相关酶活性下降。与对照组相比，单独的铜或者是与硒的联合作用在24h会下调所有测定的基因的表达，在48h会下调脂肪合成相关基因的表达，但会上调脂肪分解相关基因的表达，从而在48h会降低甘油三酯含量。因此，本研究表明，硒的添加对铜引起的脂代谢改变具有双重作用，低浓度有保护作用，高浓度表现出一定的毒性，而且存在一定的时间效应。
　　3.建立了黄颡鱼原代肝细胞的培养方法，为研究脂代谢提供了理想的体外模型。肝细胞采用含有EDTA的0.25％的胰酶进行消化，每克肝重可获得4.03×107个细胞，细胞成活率达95％。以此为模型，选取4个不同的铜浓度(0、5μM、10μM、50μM)和3个孵育时间(0、24h、48h)来研究离体条件下铜对黄颡鱼离体肝细胞脂代谢的影响。结果表明，铜对黄颡鱼离体肝细胞脂代谢的影响呈现浓度特异性:10μMCu引起脂肪消耗，可能源于脂肪分解过程的上调。而50μM铜引起脂肪消耗，可能源于脂肪合成过程的下调。而且，10μMCu诱导的脂肪分解可受PPARα阻断剂GW6471阻断，这表明PPARα通路参与了铜诱导的脂解过程。总之，铜对黄颡鱼肝细胞脂代谢的影响可能因浓度差异而表现出不同的策略。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 鱼类铜的营养与毒性研究进展

2 鱼类脂代谢研究进展

3 鱼类细胞培养研究进展

3．1 鱼类细胞培养现状

3．2 鱼类细胞培养的方法

3．3 鱼类细胞培养的应用

4 本研究的目的与意义

第二章 离体条件下铜对草鱼肝细胞脂代谢影响的研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要试剂

2．2 细胞培养和孵育实验

2．3 细胞成活率检测

2．4 生化分析

2．5 总RNA提取和荧光定量PCR

2．6 数据分析

3 实验结果与分析

3．1 铜对细胞的毒性分析

3．2 酶活性和甘油三酯含量分析

3．3 脂代谢相关的基因表达分析

4 讨论

4．1 铜对细胞的毒性分析

4．2 酶活性和甘油三酯含量分析

4．3 脂代谢相关的基因表达分析

5 小结

第三章 硒对体外铜诱导草鱼肝细胞脂代谢改变的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 试剂

2．2 细胞培养和孵育实验

2．3 细胞成活率检测

2．4 乳酸脱氢酶释放率的测定

2．5 生化分析

2．6 总RNA提取和荧光定量PCR

2．7 数据分析

3 实验结果与分析

3．1 细胞成活率和LDH释放率分析

3．2 酶活性和甘油三酯含量分析

3．3 脂代谢相关的基因表达分析

4 讨论

4．1 细胞成活率和LDH释放率分析

4．2 酶活性和甘油三酯含量分析

4．3 脂代谢相关的基因表达分析

5 小结

第四章 铜对黄颡鱼离体肝细胞脂代谢影响的研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试剂

2．2 黄颡鱼的准备

2．3 黄颡鱼原代肝细胞模型的建立

2．4 细胞成活率检测

2．5 实验分组设计

2．6 生化分析

2．7 总RNA提取和荧光定量PCR

2．8 数据分析

3 实验结果与分析

3．1 黄颡鱼原代肝细胞培养方法的建立

3．2 铜的细胞毒性分析

3．3 酶活性和甘油三酯含量分析

3．4 脂代谢相关的基因表达分析

3．5 PPARα阻断剂GW6471对铜诱导基因表达和TG含量变化的抑制效应

4 讨论

4．1 黄颡鱼原代肝细胞培养方法的建立

4．2 铜对细胞的毒性分析

4．3 酶活性和甘油三酯含量分析

4．4 肝细胞脂代谢相关的基因表达

4．5 PPARα阻断剂GW6471对铜诱导基因表达和TG含量变化的抑制效应

5 小结

第五章 结语

1 结论

2 创新点

参考文献

附录

致谢