褐飞虱内参基因的筛选及精氨酸激酶基因的分子特性研究

摘要

褐飞虱Nilaparvatalugens(brownplanthopper，BPH)是水稻上的重要害虫之一，在我国南方部分地区和长江中下游地区近年来褐飞虱经常暴发成灾，对我国水稻生产和粮食安全构成严重威胁。目前，对于褐飞虱的控制以化学防治为主，然而化学药剂导致的环境污染问题日益严重，因此当前害虫防治的研究热点集中在寻求环境友好的防止新途径。与此同时，RNAi技术已经广泛地应用于各种生物体基因功能的研究，这一技术成功地阐明了多种昆虫的基因功能。利用该技术分析基因功能的同时，也为农业害虫的生物防治开辟了RNAi沉默靶标基因的新途径。在RNAi的研究过程中，利用实时荧光定量PCR分析靶标基因mRNA水平是检测基因沉默效果的重要手段，本研究详细分析评估了不同实验条件下（不同发育时期、不同组织部位、不同地理种群、不同温度胁迫、不同药剂处理、不同食物饲喂和饥饿处理）褐飞虱8种常用持家基因actin1(ACT)、muscleactin(MACT)、ribosomalproteinS11(RPS11)、ribosomalproteinS15e(RPS15)、alpha2-tubulin(TUB)、elongationfactor1delta(EF)、18SribosomalRNA(18S)和argininekinase(AK)的表达稳定性。并且，克隆褐飞虱nlak基因的全长cDNA，分析nlak基因mRNA的组织分布和发育表达模式，构建昆虫杆状病毒重组质粒表达NlAK重组蛋白，通过RNAi探讨nlak基因作为分子靶标的可能性，为深入研究精氨酸激酶基因的表达与调控规律，阐明昆虫体内能量的代谢、贮存和利用等调控机制提供重要的理论依据，并且为利用RNAi这一新技术有效防治褐飞虱提供理论基础。研究结果如下:
　　一、褐飞虱内参基因的筛选
　　不同发育时期各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS15，RPS11，TUB，EF，18S，AK，ACT，MACT。若要采用多内参校正，需要选取RPS15、TUB、18S和EF这四个基因;不同组织部位各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS11，TUB，RPS15，18S，ACT，MACT，EF，AK。若要采用多内参校正，需要选取RPS11、18S和RPS15这三个基因;不同地理种群各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:TUB，RPS11，EF，RPS15，AK，ACT，18S，MACT。采用多内参校正时，需要选取RPS11、EF和RPS15这三个基因;不同温度胁迫下各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS15，TUB，EF，RPS11，AK，MACT，18S，ACT。采用多内参校正时，需要选取RPS15、TUB和EF这三个基因;不同药剂处理下各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS11，EF，TUB，RPS15，18S，AK，MACT，ACT。采用多内参校正时，需要选取RPS11、EF和TUB这三个基因;不同食物饲喂时各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS15，TUB，RPS11，EF，AK，18S，ACT，MACT。采用多内参校正时，需要选取RPS15、TUB、EF和RPS11这四个基因;饥饿处理下各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS11，TUB，RPS15，AK，18S，EF，ACT，MACT。采用多内参校正时，需要选取RPS11、AK和EF这三个基因;对所有处理的样品数据进行综合分析，结果发现各内参基因稳定性的综合排序从稳定到不稳定依次为:RPS11，RPS15，EF，TUB，AK，18S，ACT，MACT。此结果对于褐飞虱中基因表达分析具有重要意义，并且为进一步分析褐飞虱和其他生物内参基因稳定性奠定了基础。
　　二、褐飞虱精氨酸激酶基因的分子特性研究
　　1.褐飞虱精氨酸激酶基因(nlak)的克隆与分析
　　采用PCR、TA克隆、测序和拼接，获得了nlak基因的完整编码区序列，并通过5'-RACE和3'-RACE获得5'端和3'端非翻译区(UntranslatedRegions，UTR)序列。克隆到的nlak基因cDNA全长为1377bp，含有一个完整的1071bp的开放阅读框序列（Openreadingframe，ORF），编码356个氨基酸残基。其中，CPTNLGT位于nlak氨基酸序列第270-276位，是精氨酸激酶的活性中心。根据Prosite软件分析得出其蛋白质分子量为39.81kDa，等电点为5.69。
　　2.重组AcNPV-NlAK在昆虫杆状病毒系统中的表达
　　将同源重组的AcNPV-NlAK病毒转染健康的昆虫sf21细胞系，获得第一代重组AcNPV-NlAK病毒。该重组病毒能够继续感染新的健康的sf21细胞，在感染后的第7天可以收集到重组AcNPV-NlAK蛋白。利用抗6-His兔多克隆抗体进行WesternBlotting，检测到重组NPV-NlAK蛋白在sf21细胞中成功表达。
　　3.nlak基因在褐飞虱体内的表达分析
　　qRT-PCR和酶活性检测结果表明nlak基因在褐飞虱各个发育时期均有表达，褐飞虱卵期的nlak基因表达量远低于其他各个时期，1龄若虫和2龄若虫中表达量显著高于其它龄期若虫，并且在2龄若虫中的表达量为整个发育时期最高。此外，在褐飞虱成虫的各组织部位中nlak基因均有表达，无论在雌成虫还是雄成虫体内，头部的nlak基因表达量最高，其次是胸部，而腹部的表达量明显低于头部和胸部。并且，对于整个虫体而言，nlak基因在雄成虫体内的表达量远大于雌成虫。
　　4.nlak基因沉默后对褐飞虱的影响
　　采用饲喂法将体外合成的nlak基因dsRNA通过人工饲料导入褐飞虱体内，通过对死亡率的统计、qRT-PCR和酶活性检测发现，在饲喂初期dsRNA对nlak基因干扰效果比较明显。不同浓度和不同片段的dsRNA饲喂结果均表明，摄取dsRNA的褐飞虱第2天出现死亡率上升、mRNA水平下降和酶活力降低的现象。第3天开始死亡率变化趋于平缓，第4天开始mRNA水平变化也趋于平缓，nlak基因的表达量随着RNAi处理时间的延长呈现先降低后升高的趋势。
　　综上所述，褐飞虱RPS11和RPS15基因在大部分试验条件下表现出较高的稳定性，可以作为qRT-PCR的内参基因使用;nlak基因在褐飞虱各发育时期和各组织部位中均有较强的表达水平，该基因RNAi能对褐飞虱具有明显的致死效应，可作为防治褐飞虱的新途径，为昆虫内参基因筛选和褐飞虱基因功能研究提供了理论指导。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 褐飞虱的研究概况

2 精氨酸激酶基因的研究

2．1 磷酸原激酶概述

2．2 精氨酸激酶的蛋白质结构

2．3 精氨酸激酶的基因拷贝数及表达情况

2．4 精氨酸激酶的进化过程

2．5 精氨酸激酶与抗性的关系

3 实时荧光定量PCR内参基因的筛选

3．1 绝对定量分析和相对定量分析

3．2 筛选内参基因

3．3 数据分析方法

4 昆虫的RNAi研究进展

4．1 RNAi的作用机制

4．2 介导双链RNA进入昆虫体内的方法

4．3 昆虫RNAi效率的影响因素

4．4 昆虫RNAi的可遗传性

4．5 RNAi在害虫防治中的应用

5 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 供试昆虫

1．2 供试水稻

1．3 菌株和载体

1．4 主要仪器设备及耗材

1．5 实验试剂

2 研究方法

2．1 常用试剂及培养基的配制

2．2 褐飞虱人工饲料的配制及褐飞虱的人工饲喂方法

2．3 水稻营养液的配制

2．4 内参基因引物设计及初步筛选

2．5 不同试验条件下的试虫及其cDNA模板的挑选

2．6 内参基因稳定性的分析方法

2．7 精氨酸激酶在褐飞虱体内的表达分析

2．8 褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆、5'-RACE和3'-RACE

2．9 昆虫杆状病毒系统表达褐飞虱重组精氨酸激酶

2．10 制备dsRNA

2．11 dsRNA的饲喂

2．12 RNAi分析

2．13 数据处理

第三章 结果与分析

1 褐飞虱实时荧光定量PCR中内参基因的选择

1．1 各候选内参基因的表达水平

1．2 不同发育时期各内参基因表达稳定性分析

1．3 不同组织部位各内参基因表达稳定性分析

1．4 不同地理种群各内参基因表达稳定性分析

1．5 不同温度处理下各内参基因表达稳定性分析

1．6 不同药剂下各内参基因表达稳定性分析

1．7 不同食物饲喂时各内参基因表达稳定性分析

1．8 饥饿处理时各内参基因表达稳定性分析

1．9 所有样品内参基因表达稳定性分析

2 褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆及其分子特性研究

2．1 nlak基因克隆与分析

2．2 昆虫杆状病毒表达系统表达褐飞虱精氨酸激酶重组蛋白

2．3 nlak基因表达谱分析

2．4 nlak基因RNAi的分析

第四章 总结与讨论

1 全文总结

2 讨论

2．1 褐飞虱内参基因筛选的研究

2．2 褐飞虱nlak基因RNAi的研究

第五章 创新点

参考文献

附录 攻读博士学位期间发表文章

致谢