橘小实蝇rpl19 dsRNA对橘园非靶标昆虫干扰效应研究

摘要

RNAi是由双链RNA所引起的特异性基因沉默。喂食dsRNA达到RNAi效应在很多昆虫上取得成功，在害虫防治上表现出广泛的应用潜力，但是目前缺乏对于RNAi的安全性评价，因此评价RNAi包括对天敌和益虫等非靶标昆虫的干扰效应在内的环境安全性具有非常重要的意义。
　　本研究选取橘小实蝇Bactroceradorsalis作为靶标昆虫，rpl19基因作为靶标基因，选择近缘种柑橘大实蝇Bactroceraminax，天敌长尾潜蝇茧蜂Diachasmimorphalongicaudata，益虫意大利蜜蜂Apismellifera作为非靶标生物，同时喂食小实蝇rpl19基因不同片段的dsRNA，利用Real-timePCR等分子生物学技术检测各个昆虫rpl19的表达情况，研究昆虫dsRNA对非靶标昆虫的干扰效应，为RNAi用于害虫防治提供安全性评价的参考依据。主要研究结果如下:
　　1.成功克隆了橘小实蝇、柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂和意大利蜜蜂rpl19基因cDNA全长。基因同源性分析结果显示橘小实蝇rpl19基因ORF区域核酸序列与柑橘大实蝇同源性高达93％，与长尾潜蝇茧蜂同源性达72％，与意大利蜜蜂有68％的同源性。用CLUSTALX2.0将橘小实蝇rpl19氨基酸序列与柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂、意大利蜜蜂rpl19基因氨基酸序列同源性比对，结果显示橘小实蝇rpl19基因氨基酸序列与柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂、意大利蜜蜂同源性高达90％以上。
　　2.Real-timePCR结果表明，喂食靶标昆虫自身rpl19基因dsRNA可以在橘小实蝇、柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂和意大利蜜蜂中均产生RNAi效应，喂食Bdrpl19dsRNA后橘小实蝇rpl19基因表达分别下调50％，喂食Bmrpl19dsRNA后，柑橘大实蝇rpl19基因表达下调达90％以上，喂食Dlrpl19dsRNA后长尾潜蝇茧蜂rpl19基因表达下调40％，而喂食Amrpl19dsRNA后意大利蜜蜂rpl19基因表达下调了50％。
　　3.dsRNA对非靶标昆虫的干扰效应研究结果显示喂食橘小实蝇Bdrpl19CDSdsRNA后，柑橘大实蝇rpl19基因表达水平下调了50-70％，长尾潜蝇茧蜂rpl19基因表达水平下调了40％，而意大利蜜蜂rpl19基因表达量没有变化，但喂食Bdrpl193'UTRdsRNA对三种非靶标昆虫都没有干扰效应。而dsRNA片段核酸序列的比对结果显示柑橘大实蝇和长尾潜蝇茧蜂rpl19基因序列与橘小实蝇rpl19序列存在19-23bp完全同源的片段，而意大利蜜蜂rpl19与橘小实蝇rpl19基因序列间没有大于19bp完全相同的片段，这个结果表明RNAi的种间效应与可能基因完全同源的片段的长短有关，当完全重合区域超过19bp就可能会产生种间干扰效应，这个结果反映了RNAi用于害虫防治可能存在的风险，相比于编码区，非编码区的安全性更高，本研究橘小实蝇非编码区dsRNA对三种非靶标昆虫没有干扰效应。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 RNAi

2 RNA干扰技术在昆虫中的应用

2．1 dsRNA导入昆虫的方法

2．2 昆虫对RNAi的敏感度

2．3 RNAi在昆虫基因功能中研究现状

2．4 RNAi在害虫防治中的研究进展

3 Rpl19基因的功能研究

4 橘小实蝇防治研究现状

5 橘园昆虫群落研究

6 本研究内容与目的意义

6．1 研究内容与目的意义

6．2 技术路线

第二章 柑橘大实蝇、意大利蜜蜂、长尾潜蝇茧蜂rpl19基因全长克隆

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取

2．2 RT-PCR扩增相关基因片段

2．3 PCR产物的的克隆与测序

2．4 rpl19基因全长克隆

2．5 rpl19基因同源性比对

3 小结

第三章 橘小实蝇rpl19 dsRNA对非靶标昆虫的RNAi效应研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 dsRNA表达效果检测

2．2 dsRNA摄入效果检测

2．3 喂食Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3’UTR后橘小实蝇rpl19表达量

2．4 喂食Bmrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3’UTR后柑橘大实蝇rpl19表达量

2．5 喂食Dlrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3’UTR后长尾潜蝇茧蜂rpl19表达量

2．6 喂食Amrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl193’UTR后意大利蜜蜂rpl19表达量

3 讨论

第四章 结论与展望

参考文献

致谢