结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药性新机理研究

摘要

结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的传染性疾病，时至今日仍然严重威胁着人类的健康。自从1969年利福平被发现之后就没有1个新药被应用于临床，并伴随着结核分枝杆菌耐药菌株的出现和大规模的蔓延，导致人们在选择治疗结核病的药物时受到极大的限制，所以使得人类在结核病的防控上面临着巨大的挑战。重新评估在过去几十年里我们所使用的临床药物就显得尤为重要。现有药物的作用机理和耐药机理的阐述对于结核病的防控非常关键。
　　对氨基水杨酸(PAS)，是一种临床上用于治疗多重耐药结核病(MDR-TB)的药物，它的耐药性机理至今尚未被完全阐述。PAS作为叶酸前体对氨基苯甲酸(PABA)的结构类似物，在细菌体内可以被二氢喋酸合成酶(DHPS，FolP1)和二氢叶酸合成酶(DHFS，FolC)“活化”，进而抑制二氢叶酸还原酶（DHFR，DfrA）的活性，从而阻断以叶酸为辅酶的代谢通路。所以，FolC蛋白的突变会影响PAS在细菌体内的代谢，从而导致结核分枝杆菌H37Rv的PAS耐药。
　　在我们研究中发现，FolC底物H2Pte的结合“口袋”的氨基酸残基发生突变可以导致实验室分离的结核分枝杆菌H37Ra和牛分枝杆菌的PAS耐药菌株产生耐药性。同时我们在临床分离的85株MDR菌株中，发现有5株PAS耐药菌株同样在FolC的底物结合“口袋”的氨基酸残基发生了突变。
　　FolC的突变虽然会导致二氢叶酸合成酶活性的降低，但也同样会导致PAS无法在细菌体内被“活化”，从而阻断其掺入叶酸代谢。耐药突变体可以通过导入野生型的folC把其对PAS的敏感性恢复到野生型水平。PAS耐药新机理的阐述，不仅有利于建立临床耐药菌株分子诊断方法，而且有助于们进一步阐述PAS的作用机理。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 引言

1 结核分枝杆菌耐药机制研究进展

1．1 结核病治疗现状

1．2 结核病临床药物作用机理和耐药机理研究

1．3 结核分枝杆菌对氨基水杨酸作用机理和耐药机理研究

2 本研究的目的和意义

第二章 结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药机理研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 实验方法

2 实验结果与分析

2．1 自发突变株耐药相关基因鉴定

2．2 临床MDR菌株耐药相关基因鉴定

2．3 野生型folC回补实验

2．4 表达载体pMV361-folC，folCI43A和folC I43T转入H37Ra

2．5 转入表达载体的菌株的基因组原始folC基因的敲除

2．6 同源替换菌株药物敏感性测试

2．7 H2Pte拮抗PAS活性

2．8 突变体FolC突变位点在酶结构中的分布

2．9 不同来源的FolC序列分析

2．10．野生型和突变体FolC蛋白的表达与纯化

2．11 H2Pte为底物酶活比较

2．12 FolP1蛋白的表达与纯化

2．13 体外合成H2Pte-PAS并用HPLC-MS／ESI分离验证反应产物

2．14 H2PtePAs为底物酶活比较

2．15 野生型FolC催化两个底物H2Pte和H2PtePAs速率差异

3 讨论

第三章 结论

参考文献

发表及待发表文章目录

致谢