LPS刺激对雏鸡气管和肺TLR4表达的影响研究

摘要

呼吸系统在机体内不仅起到气体交换的作用，同时由于该系统相对开放的特点，在机体中也发挥着免疫防御的作用。外源性抗原侵入机体时，首先启动天然免疫系统，通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）对抗原进行识别，引起一系列免疫反应，实现对病原菌或外来抗原的防御作用。Toll样受体(tolllikereceptors，TLRs)是一类广泛存在于多种组织器官中的模式识别受体，在天然免疫和获得性免疫中起到了连接作用。TLR4被认为在对抗革兰氏阴性菌中发挥着重要作用。禽类中细菌性呼吸性疾病的发病率呈现上升的趋势，但是关于TLR4在鸡呼吸系统免疫反应中的作用的研究报道还比较少。因此本项目拟以鸡为研究对象，采用免疫组织化学染色、细胞特异性染色、ELISA等方法探究雏鸡受到LPS刺激后，气管和肺的组织学变化和TLR4在气管和肺中的分布及表达变化，以此来探讨LPS刺激对家禽呼吸系统的影响及TLR4在呼吸性疾病中的作用。主要研究结果如下:
　　1、LPS刺激对鸡气管组织学结构的影响
　　光镜下观察，鸡气管黏膜层分为上皮和固有层:上皮为假复层纤毛柱状上皮，主要有纤毛柱状细胞和杯状细胞，二者相互夹杂着分布;雏鸡黏膜下层的气管腺在对照组和LPS组中都很少;1周龄内的雏鸡气管的透明软骨环呈不完整的圆片状，在软骨片交接处经常见到两层软骨。LPS刺激36h和72h时，部分上皮细胞排列疏松，细胞之间的分界模糊，有些柱状细胞纤毛脱落;气管上皮的杯状细胞数量从刺激后12h开始减少，36h和72h比12h稍有增加，但仍然少于对照组(P＜0.05)。结果说明，腹腔注射LPS可以导致气管发生损伤。
　　2、LPS刺激对鸡气管中TLR4表达分布的影响
　　通过免疫组织化学染色的方法研究TLR4在雏鸡气管中的表达分布，结果显示在对照组和LPS组中均有TLR4阳性产物分布，且主要在纤毛柱状细胞的纤毛上表达，上皮杯状细胞中不表达TLR4，在固有层和黏膜下层中也可见棕黄色的TLR4阳性产物。LPS刺激后，TLR4在雏鸡气管中的表达升高，且在刺激后36h到达高峰，显著高于对照组(P＜0.05)。TLR4在LPS刺激前后的表达变化提示在受到病原菌入侵时，气管上皮细胞可能通过TLR4对其发挥作用。
　　3、LPS刺激对鸡肺组织学结构的影响
　　光镜下观察，雏鸡肺由许多肺小叶组成，小叶与小叶之间为结缔组织。三级支气管管腔在肺小叶中央，管腔周围是肺房的开口，开口处有平滑肌束;肺房呈囊腔状，上皮为单层扁平上皮，细胞外有弹性纤维;肺毛细管上皮是单层扁平上皮，细胞外有网状纤维和毛细血管。LPS刺激后12h和36h，部分肺小叶之间界限模糊，肺房管腔变狭窄，甚至减少，肺毛细管充盈，细胞受挤压而密集，肺组织淤血，在某些三级支气管管腔、肺房、肺毛细管和血管中均有大量红细胞分布，肺间质中散在分布有白细胞;LPS刺激后72h，肺的组织学结构比前两组有所好转，但在三级支气管管腔中仍有红细胞分布，肺小叶结构凌乱。该结果说明腹腔注射LPS可引起肺发生损伤和炎症。
　　4、LPS刺激对鸡肺中TLR4表达分布的影响
　　通过免疫组织化学染色的方法研究了TLR4在雏鸡肺中的表达分布，结果显示TLR4在对照组和刺激组雏鸡的肺中均有分布。阳性细胞主要表达在肺间质和血管中的细胞。通过连续切片进行HE染色、Schiff-亚甲蓝染色和免疫组化染色可以发现TLR4表达为阳性的细胞，可能为浆细胞、单核细胞或巨噬细胞、淋巴细胞或异嗜性粒细胞。LPS刺激12h和36h，肺TLR4的表达升高，72h时TLR4表达降低，且与12h和36h相比差异显著(P＜0.05)。TLR4在肺中的表达分布提示，受到病原菌刺激后，肺可能通过巨噬细胞、异嗜性粒细胞、淋巴细胞上的TLR4介导活化细胞，引起炎症反应等，对侵入机体的病原菌起到防御作用。
　　5、LPS刺激对鸡气管和肺中SIgA表达变化的影响
　　ELISA结果显示，黏膜免疫的主要效应因子分泌型IgA(SIgA)在雏鸡气管中的表达随着LPS刺激时间的延长先升高后逐渐降低，12h表达量最高，72h时表达最低。在雏鸡肺中随着刺激时间的延长变化不明显。该结果提示，气管黏膜中的SIgA可能参与了机体对LPS的反应过程，且主要在刺激早期发挥作用。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 常见呼吸系统疾病在雏鸡中的发生概况

1．2．2 TLRs研究进展

1．2．3 家禽黏膜免疫的研究进展

1．2．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验动物与器材

2．1．1 试验动物及处理

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液和试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 样品采集与处理

2．2．2 石蜡切片制作

2．2．3 苏木精-伊红(HE)染色

2．2．4 免疫组化染色

2．2．5 PAS染色

2．2．6 Schiff-亚甲蓝染色

2．2．7 ELISA检测

2．2．8 数据统计分析

3 结果

3．1 LPS刺激对鸡气管组织学结构的影响

3．2 LPS刺激对TLR4在鸡气管中表达的影响

3．3 LPS刺激对鸡肺组织学结构的影响

3．4 LPS刺激对TLR4在鸡肺中表达的影响

3．5 LPS刺激对鸡气管和肺中SIgA表达变化的影响

4 讨论

4．1 LPS刺激对鸡气管和肺组织学结构的影响

4．2 LPS刺激对鸡气管和肺TLR4表达分布的影响

4．3 LPS刺激对鸡气管和肺SIgA表达的影响

5 结论

参考文献

致谢

附录1 个人简历

附录2 论文发表情况