LPS和沙门氏菌刺激时鸡脑内TLR4的表达规律研究

摘要

由于血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的存在，中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)被认为是免疫特免区，CNS内炎症感染与免疫反应一直以来都备受关注和争议。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）的发现促进了人们对脑内炎症反应机制的认识，吸引了众多研究者的目光。TLR4是第一个被发现的TLRs，广泛分布于机体的组织细胞。有研究表明TLR4在哺乳动物CNS内胶质细胞上表达，并证实在炎症过程中，胶质细胞通过TLR4与配体结合而发挥作用。目前有关TLR4与家禽脑内炎症和免疫反应的关系缺乏系统研究报道。因此，本项目拟以2日龄雏鸡作为试验对象，研究脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和沙门氏菌刺激对脑组织结构和BBB超微结构的影响，同时检测鸡脑组织内TLR4的分布特征以及表达变化，为揭示脑内天然免疫反应机制奠定基础。主要研究内容和结果如下:
　　1.LPS和沙门氏菌刺激对脑组织结构的影响
　　本试验采用LPS和沙门氏菌腹腔注射2日龄雏鸡，探究细菌及其产物外周刺激后，脑组织结构的变化。结果显示:与对照组相比，LPS刺激后，随着时间的延长，小脑软脑膜下血管扩张、充血，软脑膜肿胀、增厚，以及浦肯野细胞层处微血管玻璃样变。沙门氏菌刺激后，小脑软脑膜下血管充血，炎性细胞浸润，血管阻塞，血管周围炎性细胞浸润，到后期，可见脑膜充血、水肿、出血，以及神经元坏死呈空泡状。与对照组相比，LPS刺激后，可见大脑软脑膜下血管充血、肿胀，软脑膜增厚，炎性物质渗出，炎性细胞增多以及组织坏死。沙门氏菌后，大脑软脑膜增厚、软脑膜下血管扩张、充血，同时在大脑皮质，可见微血管扩张、炎性细胞增加和组织坏死。以上结果提示外周注射LPS和沙门氏菌能够引起CNS内脑组织一定程度的组织结构改变和病理变化。
　　2.沙门氏菌刺激对血脑屏障超微结构的影响
　　采用电子显微镜研究沙门氏菌刺激对鸡脑内血脑屏障超微结构的影响。结果显示:生理盐水组微血管壁及其周围神经纤维网结构完整。沙门氏菌刺激12h后，微血管内皮细胞核溶解，内皮细胞骨架形态改变，细胞膜扩张。72h后，微血管周围神经纤维网退化，细胞突起消失以及神经元轴突和树突退化。研究结果提示外周微生物感染可能通过改变BBB的结构进而影响其相关功能和CNS内环境的稳定性。
　　3.TLR4在鸡脑组织内的分布特征
　　采用免疫组化染色法研究TLR4在2日龄鸡脑内的分布特征。结果显示:TLR4在2日龄鸡脑内呈组成型表达，且具有一定分布规律，主要分布在大脑的软脑膜、微血管壁和神经元以及小脑的软脑膜、浦肯野细胞以及髓质神经元，微血管壁呈现弱表达。以上研究结果表明，在正常发育条件下，鸡CNS内存在固有免疫受体TLR4，可能参与外源性刺激的识别和应答反应。同时，固有免疫的识别和启动可能不仅依赖于软脑膜和循环血流，还可能依赖于脑实质内神经元上相关免疫因子的作用。
　　4.LPS和沙门氏菌刺激对鸡脑内免疫因子表达的影响
　　本研究采用LPS和沙门氏菌外周刺激2日龄雏鸡，分别于刺激后0h、12h、36h和72h取组织样，采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内TLR4的表达水平。结果显示:大脑内，LPS和沙门氏菌刺激后，TLR4在大脑内呈先降低后升高，36h时均下降到最低值。与大脑相反的是，LPS和沙门氏菌刺激后，TLR4在小脑内呈先升高后降低的趋势，12h时达到最大值。这一结论提示，大脑和小脑对病原体外周刺激的应答反应时间可能有所不同，并且TLR4识别病原物从而被诱导表达的机制可能存在差异。
　　采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内Iba-1的表达水平变化，结果发现:在大脑内，LPS刺激后，Iba-1的表达水平升高，在12h达到最大值。沙门氏菌刺激后，Iba-1的表达亦为升高的趋势，36h时达到最大值。与大脑不同的是，在小脑内，LPS和沙门氏菌刺激后，Iba-1表达降低。这一结果提示LPS和沙门氏菌均能够活化大脑内的小胶质细胞。
　　采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内E选择素的表达水平变化，结果发现:在大脑内，LPS刺激后，E选择素的表达呈下降趋势。沙门氏菌刺激后，E选择素在短时间内表达水平降低，并在36h时下降到最低值。在小脑内，LPS和沙门氏菌刺激对E选择素表达水平的影响不显著。这一结果表面沙门氏菌对脑内微血管的影响可能需在刺激时间延长后进一步分析。
　　采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内钙卫蛋白的表达水平变化，结果发现:在大脑内，LPS和沙门氏菌刺激后，钙卫蛋白的表达水平先升高后降低，在12h时显著高于对照组水平，在72h时显著低于对照组水平。与大脑相反的是，在小脑内，LPS刺激后，钙卫蛋白表达水平降低，在72h下降到最低值。沙门氏菌刺激后，钙卫蛋白的表达先降低后升高，在36h达到最大值，与对照组相比差异显著。这一结果说明CNS内大脑可能是炎症感染发生的主要部位。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题依据

1．2 文献综述

1．2．1 CNS免疫的研究现状

1．2．2 TLRs的作用及其与天然免疫的关系

1．2．3 鸡TLRs研究进展

1．2．4 血脑屏障的研究进展

1．3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验动物与器材

2．1．1 试验动物及处理

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液和试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 石蜡切片制作

2．2．3 苏木精-伊红(HE)染色

2．2．4 两步法免疫组化染色

2．2．5 电镜切片制作

2．2．6 ELISA检测

2．2．7 图像采集及数据分析

3 结果

3．1 LPS和沙门氏菌外周刺激后不同时间点脑组织结构的变化

3．1．1 LPS外周刺激后脑组织结构的变化

3．1．2 沙门氏菌外周刺激后脑组织结构的变化

3．2 沙门氏菌外周刺激致脑内BBB超微结构的变化

3．2．1 沙门氏菌刺激对鸡大脑内BBB超微结构的影响

3．2．2 沙门氏菌刺激对鸡小脑内BBB超微结构的影响

3．3 TLR4在鸡脑组织的分布特征

3．3．1 TLR4在鸡小脑内的分布特征

3．3．2 TLR4在鸡大脑内的分布特征

3．4 LPS和沙门氏菌刺激对脑内免疫因子表达的影响

3．4．1 LPS和沙门氏菌刺激对脑内TLR4表达的影响

3．4．2 LPS和沙门氏菌刺激对小胶质细胞活性的影响

3．4．3 LPS和沙门氏菌刺激对内皮细胞活性的影响

3．4．4 LPS和沙门氏菌刺激对脑内炎症因子表达的影响

4 讨论

4．1 LPS和沙门氏菌外周刺激对脑组织结构的影响

4．2 沙门氏菌外周刺激对血脑屏障超微结构的影响

4．3 TLR4与鸡脑内的天然免疫

4．3．1 TLR4在鸡脑内的分布

4．3．2 TLR4与BBB之间的关系

4．4 LPS和沙门氏菌外周刺激对脑内免疫相关因子表达的影响

4．4．1 LPS和沙门氏菌外周刺激对TLR4表达的影响

4．4．2 LPS和沙门氏菌外周刺激对小胶质细胞活性的影响

4．4．3 LPS和沙门氏菌外周刺激对微血管内皮细胞活性的影响

4．4．4 LPS和沙门氏菌外周刺激对脑内炎症因子表达的影响

结论

参考文献

致谢

附录1 个人简历

附录2 论文发表情况