池塘表层底泥反硝化菌丰度与群落结构的研究

摘要

池塘养殖中，氮是各种水生生物所需的基本常量元素之一，但池塘中氮素积累普遍过高，对水体及养殖对象产生了较大的危害。反硝化作用作为去氮重要途径之一，对养殖水体的氮素降解起着重要作用。由于各种生境中的微生物绝大多数不可培养，因而无法运用传统的培养方法对微生物群落结构及丰度进行深入而全面的研究。分子生物学技术的发展为此类研究带来了突破口。为探究与养殖池塘水体氮素循环密切相关的反硝化菌群落结构与丰度，本文运用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对湖北省公安县崇湖渔场三种养殖模式池塘表层底泥的反硝化菌的丰度和群落结构及多样性进行了分析，并通过主成分分析和冗余度方法分析了反硝化菌丰度及群落结构与环境因子的相关性，以了解不同养殖模式底泥反硝化菌群落结构差异情况，研究结果为池塘氮素调控积累基础资料。具体研究结果如下:
　　1.池塘nirS型反硝化细菌数量全年变化于6.71×106～6.01×107copies/g之间。三种不同养殖模式的池塘底泥反硝化菌数量无显著差异(p=0.357)，类型1池塘反硝化菌变化范围为1.08×107～6.83×107copies/g，类型2池塘反硝化菌变化范围为8.60×106～6.64×107copies/g，类型3池塘反硝化菌变化范围为6.42×106～8.75×107copies/g;
　　2.每种模式池塘nirS型反硝化菌数量在月份间差异显著(p=0.000)。三种类型池塘的反硝化菌数量在9月份最高，分别为（6.27±0.59）×107copies/g、（5.58±1.03）×107copies/g、（7.25±2.12）×107copies/g;8月份次之，分别为:(4.37±0.95)×107copies/g、（3.78±1.55）×107copies/g、（5.53±1.19）×107copies/g;11月份nirS反硝化菌数量最低，分别为:（1.66±0.07）×107copies/g、（1.32±0.22）×107copies/g、(2.39±0.56)×107copies/g;
　　3.nirS型反硝化菌数量与池塘环境因子相关性分析显示，反硝化菌丰度与温度、氨氮呈显著正相关，与溶解氧呈显著负相关。主成分分析表明，无机氮、温度和溶解氧是影响反硝化菌数量的三大主要因子。
　　4.三种养殖模式池塘反硝化菌的DGGE电泳图谱共识别出54类不同条带，各个样品泳道中检测出的条带数从25～36条不等。各池塘不同月份样品中共同条带数居多，且共同条带的条带亮度较高;在非共同条带上，各泳道的条带强弱有不同的变化。结果提示，不同养殖模式池塘反硝化菌的优势种群在不同季节均保持相对稳定，而非优势种群变化较大。
　　5.池塘沉积物样品的54个特征条带的测序结果显示，属于环境样品中的不可培养菌种(Unculturedbacterium)或未鉴定菌种(Unidentifiedbacterium)条带有39条，占测序条带总数的70％以上，其他序列条带主要分布于变形菌门(Proteobacteria)和硬壁菌门(Firmate)，变形菌门(Proteobacteria)为优势菌群，其中其亚群Betaproteobacteria为优势亚群，其次为Alphproteobacteria和Gamaproteobacteria。
　　6.主成分分析结果显示池塘nirS型反硝化菌群落结构在三种养殖模式下存在差异，但多样性指数显示不同养殖模式池塘样品在不同季节中无差异。冗余度分析中的蒙特卡罗检验表明，池塘模式、月份和温度是影响反硝化菌群落结构的主要因子。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述与选题意义

1．1 养殖池塘氮循环研究概况

1．1．1 养殖池塘的氮循环

1．1．2 氮循环中的生化反应及其微生物

1．2 反硝化作用的研究概况

1．2．1 反硝化细菌的群落结构与多样性

1．2．2 反硝化细菌的生物量

1．2．3 反硝化细菌的活性与反硝化速率

1．3 微生物丰度与群落结构的研究技术方法

1．3．1 微生物多样性与群落结构的方法

1．3．2 微生物定量研究的技术方法

1．4 养殖池塘沉积物与水质的关系

1．5 选题的目的与意义

1．6 本论文的技术路线

第二章 池塘表层底泥反硝化菌数量的变动

2．1 材料与方法

2．1．1 池塘

2．1．2 泥样的采集与处理

2．1．3 底泥DNA的提取

2．1．4 反硝化菌亚硝酸还原酶基因的扩增与纯化

2．1．5 反硝化菌的定量

2．2 结果

2．2．1 反硝化菌亚硝酸盐还原酶基因扩增与纯化

2．2．2 反硝化菌的定量

2．3 讨论

第三章 池塘表层底泥反硝化菌群落结构与多样性的变化

3．1 材料和方法

3．1．1 池塘

3．1．2 泥样的采集与处理

3．1．3 实验试剂

3．1．4 样品DNA的提取

3．1．5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

3．1．6 数据处理与分析

3．2 结果与分析

3．2．1 DGGE电泳图谱分析

3．2．2 多样性指数

3．2．3 主成分分析

3．2．4 测序结果

3．3 讨论

第四章 池塘表层底泥反硝化菌丰度和群落结构与环境因子的相关性

4．1 材料与方法

4．1．1 池塘

4．1．2 泥样的采集与处理

4．1．3 实验主要试剂及配置方法

4．1．4 池塘水化指标的测定方法

4．1．5 数据处理与分析

4．2 结果与分析

4．2．1 池塘环境因子指标

4．2．2 反硝化菌数量与环境因子的相关性与主成分分析

4．2．3 池塘底泥反硝化菌群落结构与环境因子的关系

4．3 讨论

第五章 小结与展望

参考文献

致谢

附录