月季“月月红”酵母单杂交cDNA文库及RrMYB7诱饵载体构建

摘要

转录因子通过激活或者抑制基因的转录表达来调节植物体内的各种生理生化过程，植物中包含许多的转录因子家族，MYB基因家族就是其中一类。多年来人们对植物体内的MYB转录因子进行了大量的研究，分析其蛋白的结构及功能，现有研究表明MYB蛋白在植物生长发育的多个阶段包括植物次生代谢、植物细胞形态建成以及植物抗逆胁迫应答等方面都起着重要作用。目前，对MYB转录因子的研究大部分还停留在分析其生理功能或单个MYB基因的作用方面，对于MYB蛋白调控网络的研究、MYB基因家族成员间的互作以及MYB基因与其它转录因子家族之间的作用机制还缺乏了解。探讨多个基因甚至整个MYB家族基因间的复杂调控网络有助于在整体水平上利用MYB基因对植物进行定向改良，这将成为今后对MYB基因家族的研究重点。
　　为了探索MYB基因家族的复杂调控网络，可以运用酵母双杂交及酵母单杂交技术来找寻MYB蛋白及MYB基因启动子的互作蛋白编码序列。我们选择可能与植物生长与开花相关的MYB基因家族成员MYB7作为研究对象，以周年开花不断的蔷薇科植物“月月红”(Rosachinensis'Slater'scrimson China')作为植物材料，构建了“月月红”酵母单杂交cDNA文库和MYB7酵母双杂交诱饵载体PGBKT7-MYB7，并运用FPNI-PCR方法扩增出MYB7基因上游1.86kb长度序列，为后期的酵母单杂交和酵母双杂交cDNA文库筛选工作做出铺垫。具体实验内容与结果如下:
　　1.以实验室基地大棚的“月月红”花瓣与花芽为植物材料构建“月月红”酵母单杂交cDNA文库，通过检测此文库的转化效率及插入片段长度来评价文库质量。此文库转化效率为1.4×106，插入片段长度为800bp-1000bp之间，有少数自连及多片段插入情况。
　　2.以实验室已构建好的MYB7超量表达载体PMV-RrMYB7质粒为模版，克隆玫瑰MYB7基因cDNA序列全长，根据PGBKT7诱饵载体选择NcoI和BamHI酶切位点，设计引物构建酵母双杂交诱饵载体PGBKT7-MYB7，将构建好的诱饵载体转化Y187酵母菌株，挑取阳性克隆并保存。
　　3.用新的染色体步移法FPNI-PCR方法扩增MYB7上游序列，希望扩增出MYB7基因启动子。此实验部分共进行了三轮FPNI-PCR扩增反应，对每轮的测序结果进行检测确认，将三次得到的序列进行拼接后得到MYB7基因上游1.86kb长度序列。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 MYB转录因子研究进展

1．1 MYB转录因子的结构特征和分类

1．2 MYB基因家族的功能

2 酵母双杂交及酵母单杂

2．1 酵母双杂交原理

2．2 酵母双杂交技术在植物研究中的应用

2．3 酵母双杂交的优缺点

2．4 酵母单杂交原理及应用

3 研究的目的和意义

第二章 “月月红”酵母单杂交cDNA文库的构建

1 引言

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 主要试剂和药品

2．3 培养基

2．4 酵母单杂交AD-cDNA文库的构建

3 结果与分析

3．1 “月月红”花瓣与花芽mRNA和SMART双链cDNA的质量

3．2 酵母单杂交AD-cDNA文库效率的鉴定

4．讨论

第三章 MYB7基因诱饵载体的构建

1 MYB7酵母双杂交诱饵载体的构建

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 玫瑰MYB7基因酵母双杂交诱饵载体的构建

1．4 结果与分析

1．5 讨论

2 MYB7基因启动子克隆

2．1 引言

2．2 玫瑰基因组DNA的提取

2．3 引物设计

2．4 FPNI-PCR扩增

2．5 结果与讨论

第四章 前景展望

参考文献

附录

致谢