生菜紫色叶基因的遗传定位及MAGIC群体的前期构建

摘要

花青素作为一种天然的植物色素，具有很高的保健作用。花青素的生物合成及调控基因在玉米、矮牵牛、拟南芥等植物中有较深入的研究，但是在生菜中的报道相对较少。为了定位克隆生菜中控制叶紫色性状的基因，本研究对紫色生菜和绿色油麦菜进行杂交构建了叶色分离的F2代群体。从F2群体中选取50株颜色最深的建立一个混合池——紫色池，50株绿色F2植株建立绿色池。对两个极端池的叶片样本进行RNA-seq测序，得到了两个约为4.0Gb的RNA-seq数据。对两个池的RNA-seq数据进行差异基因表达分析，并对两个极端池中等位基因频率差异进行鉴定分析，得到以下结论:
　　1.共得到166个差异表达基因，功能分析发现有6个基因参与花青素生物合成途径，其中查尔酮合成酶(CHS)成功地被开发成CAPS标记，花青素合成酶(ANS)为SCAR标记，F2群体连锁分析表明这两个基因不是控制生菜叶色差异的基因;其余四个合成途径基因二氢黄酮醇(DFR)、查尔酮异构酶(CHI)、类黄酮3-羟化酶（F3H)和花青素酰基转移酶(AT)，在两个亲本中没有多态性。其它存在差异表达的基因可能是叶色差异控制基因、或者与叶色控制基因连锁的基因，也可能是叶色差异导致差异表达的基因（如光信号下游基因）。
　　2.对两个分离池RNA-seq数据分析发现三个染色体区域等位基因频率具有显著差异，推测这三个区域存在控制生菜叶色基因，分别命名为PurpleLettuceLeaf1PLL1)、PurpleLettuceLeaf2(PLL2)和PurpleLettuceLeaf3(PLL3);其中PLL1和PLL2位于距5号染色体短臂末端400Mb和100Mb附近，第三个位点PLL3位于距9号染色体短臂末端60Mb附近;本研究以PLL2为研究对象，挑选PLL2为杂合，其它两个位点为纯合的F2植株，获得F2∶3群体，表型分析发现F2∶3群体中紫色∶绿色=3∶1，表现为单基因孟德尔分离比例。后续共播种约6000个F2∶3种子，挑选其中的1372株绿色植株进行颜色控制基因的精细定位。成功地将PLL2定位于标记C5-89和C5-95之间，两个标记相隔～6Mb，遗传距离为～2.85cM。本研究为图位克隆该基因奠定了基础。
　　3.选取了41份生菜种质资源做杂交构建MAGIC群体，共得到24个不同的杂交组合的F1代，对F1代进行杂种鉴定并对选定F1杂种间进行杂交，为未来MAGIC群体构建奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 生菜简介

1．1．1 生菜起源及营养价值

1．1．2 生菜分类

1．2 花青素概述

1．2．1 花青素的生物合成途径

1．2．2 花青素生物合成关键酶

1．2．3 影响花青素合成的转录因子

1．3 基因定位与克隆

1．3．1 图位克隆(Map-based cloning)

1．3．2 混合分组分析法(Bulked Segregant Analysis)

1．3．3 转座子标签法(Transposon tagging)

1．3．4 同源序列法(Homology-based cloning)

1．3．5 数量性状基因座定位分析法(Quantitative Trait Locus)

1．3．6 关联分析法(Association analysis)

1．4 研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 植物材料

2．2 F2代紫色分离群体的构建

2．3 F2代分离群体RNA-seq测序

2．4 RNA-seq数据差异表达基因的分析

2．5 等位基因在两个极端池中测序频率差异分析

2．6 250份生菜栽培种的类型划分及多亲本高级世代互交系(Multiparent Advanced Generation Intercross，MAGIC)的前期构建

3 结果与分析

3．1 F2代分离群体分析

3．2 紫色池和绿色池RNA-seq数据统计

3．3 紫色池和绿色池差异表达基因分析

3．4 花青素合成途径基因分析

3．5 紫色池和绿色池等位基因频率差异分析

3．6 PLL2基因的遗传定位

3．7 MAGIC群体的前期构建

4 讨论

4．1 光对花青素的诱导

4．2 第二代测序与BSA法相结合的遗传分析

4．3 生菜叶色变异的遗传机理

4．4 生菜紫色叶形成的分子机理

参考文献

附录

附录1

附录2

附录3

致谢